超声波辅助提取水溶性山苦茶多糖

苏冰霞，吴学进，叶海辉，张艳玲

（中国热带农业科学院分析测试中心，海南海口 571101）

茶多糖（Tea po1ysaccharides，简称TPS）是茶叶中一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白，具有特殊生物活性。药理研究表明，茶多糖具有显著的降血糖效果和免疫活性，使茶多糖可望成为预防与治疗糖尿病及心血管疾病，提高免疫功能的天然药物[1]。若从茶叶中提取茶多糖作为保健食品的功能因子，则可为中低档茶叶的综合利用和提高社会经济效益开辟新途径。

关于茶多糖的提取方法在红茶和绿茶方面的研究报道较多，主要是酸提法、碱提法、水提法、酶提法和超声波提取法等[2]。而对山苦茶多糖提取尚无报道，山苦茶是海南植物资源中一种具有经济价值的天然产物，遍布于海南各地。其为野生的乔木树叶清蒸晾制而成，未经传统炒茶工艺，因而泡出来的茶水清香中夹着一种植物特有的味道，是一种奇特的野生茶叶，不仅香味浓烈，又能解毒清热、消食利胆，是理想的解油腻、助消化的保健饮品[3]。由于浸提条件对茶多糖的提取得率和生物活性有着直接的影响，本研究采用超声波辅助提取山苦茶多糖，在单因素试验的基础上，采用正交试验设计的方法分析影响山苦茶水溶性多糖得率的影响因子如超声波功率、超声波时间、水茶比、浸提时间、浸提温度。对浸提条件进行优化筛选，为工业化提取茶多糖提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山苦茶（购自海口农贸市场）。

石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）、95%乙醇、复合蛋白酶（诺维信公司）、氯仿、正丁醇等。

所用试剂均为分析纯。实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 试验仪器

AE200 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-3900 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；KQ3200DE 数控超声清洗机：昆山市超声仪器有限公司；植物粉碎机，回流装置一套；数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司；电热真空干燥箱：上海市实验仪器总厂；真空旋转蒸发仪：上海申生科技有限公司；循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；低速台式大容量离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 超声波辅助提取工艺流程

山苦茶→烘干粉碎至20 目茶叶末→石油醚脱脂→滤渣干燥→90%乙醇，浸提2 次→过滤→滤渣干燥→滤渣加入蒸馏水超声波辅助浸提→热水浸提（70 ℃）→滤液浓缩→Sevag 试剂和蛋白酶结合脱蛋白→80%乙醇沉淀→离心（4 000 r/min，10 min）→50 ℃烘箱干燥至恒重→得黄褐色、粉末状粗多糖→称重，计算粗多糖得率。

1.3.2 粗茶多糖得率

茶多糖得率（%）=[得到的茶多糖的质量（g）/山苦茶总质量（g）]×100。

1.3.3 多糖提取单因素试验设计

利用单因素试验分别考察液料比、超声功率、超声时间、超声温度、热水浸提时间5 个因素对山苦茶多糖得率的影响，选择最佳的提取工艺条件。

1.3.4 正交试验设计

为优化提取工艺条件，参照单因素试验结果设计正交试验L16（45），其因素及水平见表1。

表1 超声波辅助提取因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for ultrasonic assistant extraction

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对山苦茶多糖的影响

称取10g 山苦茶各五份，按液料比10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 分别加入70 ℃蒸馏水，在超声波功率200 W，超声温度50 ℃条件下超声处理30 min 结果见图1。

由图1 可知，液料比在10 ∶1～20 ∶1 之间时，山苦茶多糖得率上升最为迅速。液料比高于20 ∶1 时，多糖的得率趋于稳定，随之有所下降。这是由于山苦茶多糖从细胞到溶剂是一个由浓度差推动的扩散过程，溶剂用量越多细胞内外的浓度差就越大。当溶剂增加到一定程度之后再增加溶剂用量并不会明显提高多糖的得率。

图1 液料比对山苦茶多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

2.1.2 超声波功率对山苦茶多糖的影响

选用不同的超声波功率进行提取。称取10 g 山苦茶叶各6 份，按液料比20 ∶1 加入70 ℃蒸馏水，在60 ℃，50、100、150、200、250、300 W 条件下超声处理，结果见图2。

图2 超声波功率对大豆多糖得率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

由图2 可知，当功率较小时，山苦茶多糖的得率随着超声波功率的提高而提高，因为加大超声波功率，超声空化作用加强，机械剪切作用也加强，有助于细胞多糖的溶出。但当功率达到一定程度（200 W）时，功率再进一步提高，得率反而呈下降趋势。这是因为功率过大可能会使多糖分子降解程度加大，故超声波功率以150 W～200 W 为宜。

2.1.3 超声时间对山苦茶多糖的影响

称取10 g 山苦茶各6 份，按液料比25 ∶1（mL/g）加入70 ℃的蒸馏水，在60 ℃、200 W 的功率条件下超声处理10、20、30、40、50、60 min，结果见图3。

从图3 可知，超声波辐射时间少于40 min 时，超声波辐射时间越长，多糖得率越高。处理40 min 时多糖得率达到最大。超声波辐射时间再延长，多糖得率开始缓慢下降，可能是由于超声波较强的机械剪切作用，长时间处理不仅会使大分子多糖降解，同时也使蛋白质等其他杂质开始溶出，得到的多糖含量下降。故用超声波处理多糖浸提液的时间以40 min 为宜。

图3 超声波辐射时间对山苦茶多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

2.1.4 提取温度对山苦茶多糖得率的影响

称取10 g 山苦茶各五份，按液料比20 ∶1（mL/g）加入蒸馏水，蒸馏水温度分别为50、60、70、80、90 ℃，超声波条件调至60 ℃、200 W 功率条件下处理40 min，结果见图4。

图4 提取温度对山苦茶多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of Mallotus furetianus tea polysaccharides

由图4 可知多糖得率随提取温度的升高不断提高，因为提取温度升高会加快溶液的扩散速率，促进细胞内的多糖物质向外扩散。提取温度为70 ℃时得率达到最大，提取温度过高还会破坏山苦茶多糖的结构，故提取温度选择70 ℃为宜。

2.2 超声波辅助提取正交试验

设定热水浸提温度70 ℃，以山苦茶多糖得率作为评价指标，确定最佳提取工艺条件，各因素试验安排及结果见表2。

由表2 中极差大小可以看出，超声波功率（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、液料比（D）、浸提时间（E）对山苦茶多糖得率影响的大小顺序是A＞C＞B＞E＞D；根据正交试验结果最佳工艺条件为A3B2C4D3E1，即超声波功率200 W、超声时间40 min、超声温度70 ℃、液料比20 ∶1，此时多糖得率为9.976%。由表3 可知，超声波功率和超声温度对山苦茶水溶性多糖溶出影响显著，其他三个因素影响不显著。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

表3 茶多糖正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment of tea polysaccharides extraction

3 讨论

1）热水提法提取物的杂质较多，但较简便易行。而采用超声波辅助提取法提取，利用超声波产生的强烈振动、超高的速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速有效成分进入溶剂，超声波技术因具有成本低、安全、操作简单、污染小或无污染等一系列优点近年来越来越多地被用于有效成分的提取[4]。

2）将山苦茶脱脂及小分子糖类等杂质后，采用单因素试验和正交试验的结果得出，超声波辅助提取山苦茶多糖的最佳工艺为超声波功率200 W、超声时间20 min、超声温度70 ℃，热水浸提温度70 ℃、液料比20 ∶1 时，浸提时间30 min 时，水溶性山苦茶多糖的得率为9.976%。在影响茶多糖提取得率的5 个因素中，超声波功率和超声温度的影响达到显著水平，而超声时间、热水浸提时间、液料比的影响不显著。因此确定了山苦茶多糖超声波辅助提取工艺的可行性，为山苦茶的开发研究提供实验数据和前期基础工作。

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