木瓜蛋白酶水解胡子鲶的研究

2013-07-22周燕芳

食品研究与开发 2013年11期

周燕芳

（韩山师范学院化学系，广东潮州 521041）

胡子鲶，俗称塘鲺，在分类上属鲤形目、胡子鲶科，属于热带、亚热带鱼类，广布于我国南方各地，既是营养丰富的消费品，同时具有较好的药用及滋补作用[1]。胡子鲶适应能力强，容易养殖，成本较低，是重要淡水鱼类养殖对象。一般只作为人们餐桌的食用鱼类之一，本试验根据胡子鲶鱼类的易养殖、产量大的特点，结合多肽、氨基酸等具有生物活性物质（如对鳙鱼[2]、鳗鱼[3]、鸡肉[4]等的研究）的开发前景，对胡子鲶鱼蛋白酶水解条件进行研究，通过对木瓜蛋白酶水解胡子鲶的水解条件的研究，目的是找出最佳的水解途径，以便为胡子鲶功能食品开发和利用做一些探索性研究。

1 实验部分

1.1 试验材料及主要仪器、设备

1.1.1 试验材料与试剂

胡子鲶：购于潮州市桥东市场；

木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/mg），其它试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

501 超级恒温槽：上海恒平科学仪器有限公司；800 型离心机：上海手术器械厂；FA2004N 电子天平：上海精科；数显精密pH 计；微量凯氏定氮仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程[5]

新鲜胡子鲶→蒸熟、压榨（去脂肪）→65 ℃烘干、捣碎的鱼粉（备用）→称量→加水稀释→调pH→加温酶水解→灭酶（100 ℃，10 min）→冷却→离心（15 min）→收集上清液，定容至50 mL→分析

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 氨基态氮含量的测定

采用双指示剂甲醛滴定法[6]。

取两个干净的三角瓶，各吸取10 mL 酶水解液，第一个瓶中加入5 mL 甲醛和3 滴酚酞，摇匀、静置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 标准液滴定，消耗体积为V1；第二个瓶中加入3 滴中性红指示剂，摇匀、静置1 min后，用0.01 mol/L NaOH 标准液滴定，消耗体积为V2。按下式计算胡子鲶酶水解液中氨基态氮含量：氨基态氮含量/（mg/L）=c×（V1-V2）×10×0.014×1000/0.01L，式中：c 为NaOH 标准液浓度，（mol/L）。

1.2.2.2 原料总氮量的测定

微量凯氏定氮法[7]。

1.2.2.3 水解度的测定

水解液中游离氨基态氮含量/原料总氮含量×100%[8]。

1.2.3 试验设计[9]

酶用量、底物浓度、酶水解温度、酶水解时间和pH均对木瓜蛋白酶对胡子鲶鱼蛋白的水解有影响。本试验采用单因素试验（即在其它因素不变的情况下研究某一因素对酶水解效果的影响），确定各因素的最佳条件，再采用L9（34）[10]正交表进行正交试验，以氨基态氮含量为指标，确定木瓜蛋白酶的最佳酶水解条件。

1.2.4 酶水解液的制备

称取一定量捣碎的鱼粉，按比例加入蒸馏水，预热至设定温度，调pH 至规定值，加酶恒温水解一定时间后移至沸水浴中，进行灭酶活10 min，离心取上清液即为水解液，定容至100 mL。取酶水解液进行测定。

2 实验过程与结果分析

2.1 单因素的研究

2.1.1 酶用量对酶水解效果的影响

酶用量对水解度的影响在胡子鲶水解的过程中，木瓜蛋白酶的用量是影响水解程度的一个因素，在底物浓度为2.5%、温度为50 ℃，水解时间4 h、pH 为7.0的条件下，分别配制酶浓度为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%的胡子鲶浆液，以水解度为考察指标，结果见图1。

图1 酶浓度对水解效果的影响Fig.1 Effect of density of protease on hydrolyzation

由图1 的结果可看出，随着酶用量的增加胡子鲶蛋白的水解度逐渐增加，但木瓜蛋白酶的浓度达到一定程度后，水解度随着加酶量的变化趋势有所缓慢。因此，木瓜蛋白酶水解胡子鲶的最佳酶浓度为1.6%左右。

2.1.2 底物浓度对水解效果的影响

分别配制底物浓度为2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%的胡子鲶浆液，调节其pH 为7.0，酶浓度为1.6%，50 ℃下水解4 h 后测定其水解度，找出最佳的底物浓度，见图2。

图2 底物浓度对水解效果的影响Fig.2 Effect of density of substretum on hydrolyzation

由图2 可见，底物浓度在3.5%左右胡子鲶水解度相对较高。随着底物浓度的增加，胡子鲶的水解度有所下降这主要是由于底物浓度过高，体系的有效水浓度降低这就降低了底物与酶的接触几率。因此，胡子鲶水解的最佳底物浓度为3.5%左右。

2.1.3 酶水解时间对酶水解效果的影响

在试验中选取底物浓度为3.5%，酶浓度为1.6%，pH 为7.0，温度为50 ℃下对胡子鲶蛋白进行酶水解，研究酶水解时间对水解度的影响，结果见图3。

图3 酶水解时间对水解效果的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on hydrolyzation

由图3 可见，在最初5 h 内水解度随酶水解时间的增加而迅速提高，当达到一定时间（5 h）后，水解度的增加变得缓慢，基本上趋于不变。因此认4 h～5 h 为木瓜蛋白酶酶水解胡子鲶蛋白的最佳时间。

2.1.4 酶水解温度对酶水解效果的影响

选定底物浓度为3.5 %，酶浓度为1.6 %，pH 为7.0，分别在40、45、50、55、60、65 ℃下水解5 h，通过水解度的具体数值确定最佳温度，见图4。

由图4 可见，在温度为40 ℃～50 ℃范围内水解度随着温度的提高而增大，当温度再增加时水解度反而有所下降。这主要是由于温度对木瓜蛋白酶的影响，温度太高会使酶灭活，而温度过低则酶的活性不足，两者会导致水解度的降低，因此最佳的酶水解温度为50 ℃左右，这时酶的活性最高。

图4 酶水解温度对水解效果的影响Fig.4 Effect of temperature on hydrolyzation

2.1.5 体系初始pH 对酶水解效果的影响

选取底物浓度为3.5%，酶浓度为1.6%，温度为50 ℃，在不同pH 条件下水解5 h，确定最佳酶水解pH，见图5。

图5 pH 对水解效果的影响Fig.5 Effect of pH on hydrolyzation

由图5 可看出体系初始pH 对水解度有一定的影响，当pH 在6～7.5 范围内，水解度随着pH 的增加而提高，当pH 大于7.5 时水解度随着pH 的增加反而有所下降。这就说明采用木瓜蛋白酶水解胡子鲶时，酶水解液的最适pH 为7.0～7.5 之间。因此，本试验体系的起始pH 固定在7.0。

2.2 胡子鲶最佳酶水解工艺条件的确定

根据以上单因素试验，确定了酶用量、底物浓度、酶水解时间、体系起始pH 以及酶水解温度。其中体系的起始pH 采用固定值7.0，综合考虑酶水解过程是同时受各因素的影响，故采用三水平四因素即L9（34）进行正交试验，确定酶水解的最佳工艺条件。各因素及相应水平见表1。

从表1 可知，在这几个因素中，酶浓度对水解效果的影响最为显著，各因素对胡子鲶鱼蛋白酶水解效果影响的大小顺序是：酶浓度＞底物浓度＞酶水解温度＞酶水解时间。胡子鲶鱼蛋白的最佳酶水解条件为A3B1C3D3，因为该条件没有出现在正交表里，所以进行验证实验，即在酶水解温度为55 ℃的条件下，底物浓度为3.5%，，酶浓度为1.8%，酶水解6 h 后胡子鲶蛋白获得最大水解度为30.65 %。所得结果水解度30.65 %＞29.00%（正交表里的最大值），所以该正交试验结果可靠。