沙田柚中不同部位黄酮类物质的分布及含量探讨

阳梅芳，曾新安，杨 星

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;2.广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东广州 510640;3.广州现代产业技术研究院农产品精深加工技术中心，广东广州 511458)

柚子是柑橘中的一大类，是人们喜爱的水果之一，有天然水果罐头的美称。然而多年来人们比较重视柚子果实的利用而忽略了对柚皮资源的开发，在柚子果实加工后，大约剩下50%皮渣，传统的方法是将其进行填埋或加工成饲料，从环境和经济的角度分析都是不科学的解决途径。柚子中含有大量的黄酮类物质，近年来，从柚皮中提取黄酮类等生物活性物质受到广泛的关注［1－7］，不同柚子种类以及它们的提取物的抗氧化性均得到了证实［8－10］。柚皮黄酮类化合物主要为柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷等黄烷酮类，其中柚皮苷占80%以上［11］，但是不同柚子品种中黄酮类物质含量和种类不相同。柚皮苷是一类天然黄酮类(Flavonoids)，主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其变种的果皮中［12－13］。柚皮苷被广泛应用于医学、食品科学、化学等方面。黄酮类化合物是一类在植物界中分布广泛、具有多种生物活性的多酚类化合物。黄酮类化合物也是植物经光合作用产生的一大类化合物，是以黄酮2－苯基色原酮为母核的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体异黄酮及其原产物黄烷酮。黄酮类化合物广泛分布在植物界中，在植物的叶子和果实中少部分以游离形式存在，大部分与糖结合成苷类以糖配基的形式存在。近年来研究表明，黄酮类物质具有维持血管正常渗透压，降低血管脆性，降低人体胆固醇含量，抗过敏，降血压，抑制癌变和抗病毒作用［14］。本实验研究柚子的各个有效部位中黄酮类物质的分布，采用HPLC－ELSD分析不同部位的黄酮类物质的分布和含量种类差异。为以后的强化柚皮黄酮的提取提供了有效的数据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

柚子 市售，沙田柚;芦丁标准品(纯度为99%)国药集团化学试剂有限公司;柚皮苷标准品(纯度为98%)、橙皮苷(纯度为98%)、新橙皮苷(纯度为98%) 南京泽朗医药;95%乙醇;亚硝酸钠、甲醇(色谱纯) 上海凌峰化学试剂有限公司;硝酸铝、乙腈(色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钠 南京化学试剂有限公司。

1260型高效液相色谱仪 安捷伦;Alltech 3300蒸发光检测器 ELSD;TU－1901双光束紫外可见分光光度计 北京普析科学仪器有限公司;KQ－100DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;DHG－9620A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;DQ－XP22柚子削皮机 广州达桥食品设备公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚子不同部位中总黄酮类物质的分布

1.2.1.1 标准曲线制备 标准液的配制:精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品10mg，置50mL容量瓶中，用60%乙醇溶解并定容，得到浓度为0.2g/L的芦丁标准溶液。

标准曲线的绘制:采用戴维斯法测定总黄酮(传统方法)。精密量取标准溶液各 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于25mL容量瓶中，分别加60%乙醇溶液至10mL，再依次加入1mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min后加入1mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6min后加入4%氢氧化钠溶液1mL，再加60%乙醇定容，摇匀，放置15min后在500nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，制作标准曲线，如图1所示，得到标准曲线的回归方程为:A=12.546C－0.0047，R2=0.9993。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.1.2 总黄酮类物质的测定 将柚子的油胞层、白囊衣、内囊衣、果肉和果核打碎，准确称取5g于三角瓶中，加入无水乙醇50mL，超声辅助提取(45℃，100W，30min)，过滤，定容，取待测液适量，按照标准曲线的方法在500nm下测定其吸光值，计算含量。实验进行三次，取平均值。

1.2.2 柚子不同部位黄酮类物质的种类

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱(waters symmetry C18，4.6mm ×150mm，5μm);流动相∶乙腈－水 =(23∶77，v/v);流速 1.0mL/min;柱温 25℃;进样量 20μL。ELSD条件:漂移管温度52℃;气体流速1.6mL/min;增益值1。

1.2.2.2 实验流程 将柚子果实中的各个有效部位按照流程图2进行，研究不同部位的黄酮类物质。流程图2中的水洗条件为用1000mL蒸馏水浸洗一次;干燥条件为在45℃烘箱中干燥;提取条件为准确称取干燥样品2g，各加入20mL甲醇，密封，称量，超声波辅助提取(功率100W，温度45℃，时间30min)。得到样品A～J。

图2 柚子黄酮类物质种类研究的流程图Fig.2 The process of the study of kinds of flavonoids in Shatian grapefruite

1.2.2.3 标准品溶液 分别精密称取柚皮苷0.0109g，橙皮苷0.0038g，新橙皮苷0.0103g混合于烧杯中，用甲醇溶解，定容至10mL，配制成浓度分别为1.09、0.38、1.03g/L的贮备液，将储备液用甲醇稀释至不同的浓度，制成一系列梯度混合对照品溶液。1.2.2.4 供试品溶液 将上述流程图中A～J样品均取样过0.45μm有机膜，待测。

2 结果与分析

2.1 柚子不同部位总黄酮类物质的分布

由图3可知，内囊衣中黄酮含量最高，浓度为4.657mg/g;果核中黄酮类物质含量最低，浓度为0.333mg/g。果皮、果肉和果核三者之中，果皮中含量最高，与文献相符［15］。白囊衣和内囊衣中含有大量的纤维素，黄酮类物质容易和糖类物质结合形成黄酮苷类物质，这可能导致纤维素对黄酮类物质有一定的富集作用。

2.2 HPLC－ELSD分析柚子不同部位黄酮类物质含量和种类差异

2.2.1 三种物质的线性范围和线性方程 建立用HPLC－ELSD检测柚皮中主要三种黄酮类物质的方法，由表1可知，在一定浓度范围内，柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷均呈现良好的线性关系，该方法可以用来检测样品中的黄酮类物质。X为峰面积的对数，Y为浓度的对数。由图4可知，在上述液相条件下有很好的分离度。

图3 柚子各部位总黄酮类物质的分布Fig.3 The distribution of flavonoids in different parts in Shatian grapefruit

表1 3种主要黄酮类物质的线性关系和线性范围Table1 Linear regress equation and linear range

图4 混合标准品的液相色谱图Fig.4 Graph of the HPLC－ELSD of mixed standard substance

2.2.2 柚子不同部位柚皮苷含量分布 吴倩等［15］研究表明柚子中主要是柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三种黄酮类物质，由色谱分析可得出柚子中大部分黄酮类物质为柚皮苷，柚皮苷的色谱图像如图5所示，不同部位待测样品的柚皮苷含量结果如图6所示。在待测样品中，柚皮苷浓度最高的是内囊衣I，柚皮苷含量为0.99mg/mL，柚皮苷总量为19.8mg。油胞层压榨汁A的体积为20mL，浓度为0.287mg/mL，总量为5.74mg;样品白囊衣水洗液E的柚皮苷含量是0.452mg/mL，体积为1000mL，柚皮苷总量为452mg，样品果汁G的柚皮苷含量是0.22mg/mL，体积为90mL，柚皮苷总量为19.8mg。样品 D、F、H、J的体积均为 20mL，总量依次为 18.16、19.76、4.2、2.6mg。

由于在一个柚子果实中每个有效部位的质量不一样，所以需要按照质量比折算成整个果实柚皮苷的含量。一个新鲜柚子果实(1kg)中，油胞层0.1kg(10%)、白囊衣 0.2kg(20%)、内囊衣 0.1kg(10%)、果核0.05kg(5%)、果肉0.5kg(50%)。干燥后，油胞层20g、白囊衣50g、内囊衣20g果核/10g。油胞层中柚皮苷含量为5.74mg;白囊衣柚皮苷含量大约为490mg;内囊衣柚皮苷总量为198mg，果肉中柚皮苷总量为24mg，果核中柚皮苷含量为13mg。柚皮苷浓度最高的部位是内囊衣，柚皮苷总量最高的是白囊衣。由图6可知，油胞层中的油层中柚皮苷未被检测到，说明油胞层中的柚皮苷是存在于水相的。白囊衣样品D、E、F的柚皮苷总量可知，白囊衣中的柚皮苷存在于纤维结构里面和纤维结构之间，可以水洗下来。果核和果汁中的柚皮苷总量较低。

2.2.3 柚子不同部位黄酮类物质的种类 由HPLCELSD结果分析可知，柚子油胞层比其他有效部位的黄酮种类要多一种，根据文献可知柚子黄酮类物质主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。但是，在本实验中，柚皮的各个有效部分在实验检测条件下均没有检测到橙皮苷和新橙皮苷，可能是由于含量过少，在样品提取处理中没有提取出来。样品中大部分的黄酮类物质为柚皮苷，与文献相符。油胞层中的柚皮苷绝大部分存在于压榨汁中，油胞层中的黄酮类物质是以果皮的水相中，白囊衣的三种处理方式(直接干燥、水洗后干燥和直接水洗)得到的黄酮类物质种类一致，白囊衣水洗液中含有柚皮苷，白囊衣中柚皮苷可以用水清洗下来，这个说明柚皮苷是和白囊衣中的组织结构以物理形式结合起来的。

图5 柚皮苷的HPLC－ELSD图谱Fig.5 Graph of the HPLC－ELSD of naringin

图6 柚子中各个部位的柚皮苷浓度Fig.6 The concentration of narigin in virous parts

3 结论

柚中黄酮类物质主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷三种，通过柚皮苷浓度比较，大部分黄酮类物质为柚皮苷，而橙皮苷和新橙皮苷含量很微少。其中，内囊衣中浓度最高，其次为白囊衣，柚皮苷总量为白囊衣最多，可能是由于白囊衣中富含果胶等多糖类物质，黄酮类物质大多以与糖结合的苷类形式存在。白囊衣的水洗液和直接干燥物中的黄酮成分一样，只是含量不同，而且大部分黄酮类物质可以水洗浸出，黄酮类物质可能存在于白囊衣的纤维组织之间，并且以物理的结合方式存在于果实中。柚子黄酮类物质的存在与组织结构的关系有待进一步研究。

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