产单核细胞增生性李斯特氏菌致病机制的研究进展

萨仁高娃，胡文忠 ，姜爱丽，马 杰，3，冯 可，4

(1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034;2.大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600;3.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;4.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连116024)

李斯特菌(Listeria)是一种典型的胞内寄生的革兰氏阳性短杆菌，共分为2个群，7个种。第一群包括产单核细胞增生性李斯特氏菌(L.monocytogenes，LM)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)、无害李斯特菌(L.innocua，又名英洛克李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L.welshmei)及西尔李斯特菌(Lseeligeri);第二群为较少见的格氏李斯特菌(L.grayi)和莫氏李斯特菌(L.murrayi)［1］。其中产单核细胞增生性李斯特氏菌(简称单增李斯特菌，LM)被认为是引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌［2］。李斯特菌病临床表现为人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产、热性胃肠炎等，临床死亡率高［3］。该菌广泛存在于土壤、动物、水产品等中，能在高盐、低温、长时间干燥、以及pH5.6～9.8等多种环境条件下生存和繁殖，主要通过食品(如奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等)传播。20世纪80年代以来，LM在加拿大、瑞士、美国、英国、法国等国家曾多次发生流行或暴发流行;我国各地食品监测结果显示LM污染在食品中普遍存在，并在云南、福建、浙江等省还曾报道单增李斯特菌(病)在畜禽和人间引起暴发［4-6］。

1 生物学特性

1.1 形态与染色［7］

LM为两端钝圆，稍弯曲的小杆菌，大小约为(0.4～0.5)μm ×(0.5～0.2)μm，有时呈弧形。多单在，有时呈“V”字型或栅状排列。粗糙型(R)菌落中的细菌呈长丝状，长达50～100μm。在20～25℃下可形成4根周身鞭毛，能运动;在37℃下可形成较少甚至1根鞭毛。

此菌无荚膜，无芽孢。革兰氏染色阳性，陈旧培养物有时可脱色为阴性。常呈两极染色，无抗酸性。刚分离出来的细菌具有多形性倾向，有时误认为棒状杆菌和链球菌。在感染动物的组织内，呈球杆状。

1.2 培养特性

LM为需氧及兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。本菌营养要求不高，在普通营养琼脂平板上36℃培养24h呈细小、半透明、微带珠光的露水样菌落，直径约0.2～0.4mm，在斜射光下，菌落呈典型的蓝绿色光泽。在血平板上36℃培养24～96h，菌落呈β溶血［8］。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSA YE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45℃角入射光照射菌落，通过解剖经垂直观察，菌落呈蓝色、灰色或蓝灰色［7］。于37℃在半固体培养基中穿刺培养24h，可看到沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩散，在培养基表面下3～5mm处呈现密集的伞状［9］。

1.3 生化反应

由于菌株不同，糖发酵结果有差别。本菌一般可分解葡萄糖及(水)杨苷，37℃ 24h时产酸;对伯胶糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、鼠李糖、松甜糖、糊精、马栗苷、山梨醇及甘油等糖类，于3～10d产酸不发酵;对棉实糖、肌醇、卫矛醇、侧金盏花醇及甘露醇等则不发酵。不利用枸椽酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸和鸟氨酸均阴性。VP、甲基红和精氨酸双水解阳性［10］。陈倩等［11］用VITEK对LM进行系统的生化鉴定，结果显示蛋白胨、杆菌肽、奥普托钦、6%NaCl、10%胆汁、七叶苷、红四氮唑、右旋葡萄糖、水杨素、海藻糖和纤维二糖为阳性;半纤维素酶、40%胆汁、精氨酸、尿素、新生霉素、乳糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、蔗糖、阿拉伯糖、丙酮酸、淀粉、菊糖、蜜二糖、松三糖、核糖、木糖为阴性。

1.4 抵抗力

LM可在较极端的环境中生长和存活。此菌对热的抵抗力较弱，60℃ 30min、80℃ 1min即可全部灭活。对低温有较强的耐受性，-20℃低温仍可部分存活，并可抵抗反复冷冻［12］。酸碱对该菌具有较强的抑制作用，pH4.5～6.5生长活跃［13］，最适宜生长的 pH是 5.5［13-14］，pH4.0 以下和 pH9.0 以上均不能生长［12］。对NaCl的抵抗力强，在含1%～4%NaCl的TSB-YE肉汤中生长良好;在含8%～12%NaCl的TSB-YE肉汤中生长停滞;在含16%～20%NaCl的TSB-YE肉汤中菌数有所下降，但仍有部分残存。对化学杀菌剂及紫外线照射均较敏感:75%酒精30min、1‰新洁尔灭30min、1‰高锰酸钾15min、紫外线照射30min，均可全部杀灭该菌［12］。超高压协同温度处理可以控制LM的增值，孙新生等［15］建立了超高压协同温度处理烟熏火腿中单增李斯特菌生长模型，结果表明，超高压协同处理的温度增高显著延长了单增李斯特菌在烟熏火腿修复生长的延滞期，接种106cfu/g单增李斯特菌的烟熏火腿在40℃协同600MPa处理5min后，可使产品在保质期内计数时低于检测线。LM对庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、头孢噻吩、头饱唑啉、诺氟沙星、氧氟沙星、红霉素、四环素、氯霉素敏感;对依诺沙星和呋喃妥因耐药［16］。

1.5 血清型

根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原，LM分为16个血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b 和 7。抗原结构与毒力无关，对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b，占全球本病病例约 90%［17-19］。

2 毒力因子

LM是典型的胞内寄生菌，不仅可以在吞噬细胞内生长，也能在上皮细胞和肝细胞内生长。可以通过损伤的黏膜经神经末梢的鞘膜侵犯中枢神经系统。本菌编码与胞内寄生生活循环有关的毒力基因有2簇，称为李斯特菌毒力岛1(LIPI-1)和李斯特菌毒力岛2(LIPI-2)。LIPI-1有6个基因，两侧分别为prs和ldh位点，从prs下游开始，依次为转录活化因子编码基因(prfA)、-(plcA)、-(hly)、-(mpl)、-(actA)、-(plcB)。LIPI-2又称为内化素小岛，内化素是指一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族，分为2个亚族，亚族1的代表是由inlAB基因编码的inlA和inlB多肽，亚族2是由相对分子质量较小(25000～30000)的蛋白质组成，原形来自单增李斯特菌的 inlC［20］。

2.1 李斯特菌溶血素(Listeriolysion O，LLO)

LM的毒力基因有很多种，其中具有特异性的毒力基因是溶血素基因(Hemolytic factor gene，hly)，hly基因可编码LM的溶血素O(LLO)，它的分子量为58ku，属于胆固醇依赖细胞溶素家族，参与LM一级和次级吞噬小体的逃离［21］。1944年，Harvey等首次报道了LM可产生溶血素，随后人们又对LLO进行了诸多方面研究。LLO是LM主要的致病因子，促进菌体进入宿主胞液［22］，是细菌得以在胞液内增殖的先决条件，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。目前的研究表明，LLO是一个多功能毒力因子，能引起宿主细胞多种反应，如细胞增殖、黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中细胞因子的表达、树突状细胞的凋亡、磷脂代谢及引起机体产生免疫反应等［23-24］。目前对hly基因研究很多，由于该基因是LM的特异性毒力基因，因此，可选择该基因的合适片段建立PCR检测方法和核酸探针检测方法，可特异性检测LM。

2.2 肌动蛋白聚集因子(ActA)

作为一种细胞内寄生病原菌，LM进入细胞质中后快速复制并表达一些膜相关蛋白，这需要基于宿主细胞肌动蛋白的活动，并将之传播到邻近细胞。actA基因编码合成菌体肌动蛋白聚集因子ActA，表面蛋白ActA通过诱导细胞肌动蛋白分子的聚合作用促使细菌在细胞与细胞之间的传递，同时也与细菌被宿主细胞内化有关［25］。ActA依赖宿主细胞的细胞支架产生肌动蛋白聚集和聚合物，该聚合物在细菌的菌体尾部进行聚集，而单一的菌体蛋白就足以引起肌动蛋白聚集并形成聚合物，并为细菌提供动力。当ActA被吸附到细菌菌体表面后，在诱导期形成ActA细胞骨架。细菌如果依赖了ActA后，相比野毒株而言其虽然也可以在胎盘中存活，但是感染邻近细胞的能力大为减弱［26］。ActA缺失可导致毒力降低。殷月兰等［27］成功构建了毒力因子 ActA和PC-PLC双缺失的突变株，结果显示，突变株的毒力显著降低，对小鼠半数致死剂量比野生型菌株提高很多。Dussurget等［28］研究显示，由于ActA缺失突变株的硫酸乙酰肝素识别功能改变，从而导致对鼠巨噬细胞IC-21和中国苍鼠卵巢上皮细胞的黏附和侵袭力显著降低。

2.3 转录活化因子(PrfA)

PrfA属于细菌转录激活因子，积极调节大多数已知的LM毒力基因［29］。PrfA调节产物包括细胞表面蛋白，其参与宿主细胞侵入和细胞与细胞间的播散机制，同时分泌细胞膜破坏因子并介导细菌从细胞泡的逸出。有证据表明PrfA结合多种环境信号依照LM的特别需要来调节毒力基因的表达。Lindback T等［30］人对从鱼肉加工厂分离出的非溶血性的LM菌株测序prfA基因，发现有7bp的基因可阻断prfA蛋白，但将此菌株注射到小鼠腹腔，致死率达到60%，证明这种阻断是可逆的。PrfA由233个氨基酸组成，以活性和非活性两种形式存在，可能通过协同因子将信号传导给PrfA转录系统，使其由一种形式转变成另一种形式。PrfA能够特异性地识别被调节基因转录起始位点上游41bp处的回文结构，其调节效应强弱与回文结构对称互补程度有关［13］。

2.4 磷脂酶C(phospholipase C，PLC)

LM能产生两种磷脂酶C:磷脂酞肌醇磷脂酶(phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)和磷脂酞胆碱磷脂酶C(phosphatidylcholin phospholipase C，PC-PLC)。PI-PLC由plcA基因编码，PC-PLC由plcB基因编码。PI-PLC系以活化的形式合成，而PC-PLC则先以非活化的前肽被分泌出来，然后在胞外由mpl的基因产物Mpl蛋白酶加工。PI-PLC可辅助细菌逸出初级吞噬体，而细菌在细胞与细胞之间的扩散过程中，PC-PLC则表现出一定的活性作用［31］。Angelika 等［32］证明，PC-PLC 的活性除了对在人类上皮细胞中初级吞噬体的溶解是必需的，而且对细胞与细胞之间的扩散也是必需的。在李斯特菌属中，只有单增李斯特菌和绵羊李斯特菌分泌PI-PLC。可以利用plcA基因通过PCR反应特异地检测出 LM，Rawool针对 plcA基因特异地检测出了 LM［33］。

2.5 细胞壁水解酶(P60)

侵袭蛋白相关基因(Invasion associated protein gene，iap)也是一种毒力基因可编码P60蛋白，它是细胞外蛋白，分子量为60×103，由484个氨基酸残基组成，具有细胞水解酶和酰胺酶活性。它与细菌侵入成纤维细胞有关，突变株毒力显著下降，可能的原因是突变株在细胞间扩散的能力下降了。iap基因的两端为保守区域，中间为可变区域。P60介导李斯特菌侵袭入非专职吞噬细胞，能调整宿主细胞阻止LM侵染的能力［34］。根据iap基因建立PCR检测方法和ELISA等方法可作为李斯特氏菌属的特异性检测。Yu等［35］构建了两个单克隆抗体:识别LM的P60和识别李斯特菌属的P6017，并依据此建立了ELISA系统鉴定LM和李斯特菌属。

2.6 表面蛋白104(Surface protein 104，P104)

LM表面蛋白P104已被证实对于肠道细胞的黏附非常重要［36］。LM的生长条件如温度、pH以及铁的获取可以影响其某些毒力因子的表达。研究发现，a.LM虽可在较低的温度(4～25℃)下生长繁殖，但LLO的产生减少甚至不产生，然而将LM放置在37℃下仅需2h，其LLO的表达水平既可恢复正常;当温度提高至56℃ 20min时，LLO的活性减弱，LM对鼠的致病性也随之降低;尽管LM可生长在较高的温度下(42℃)增加黏附蛋白的表达，但这与LM毒力的增强并不完全一致，因为，对于LM的黏附和感染宿主细胞来说，所需的黏附分子相对很少;b.当LM在pH4.5～4.9的环境中，其 LLO的产生减少，对Caco-2培养细胞的侵袭性也会减弱，酸适应的LM比非酸刺激的LM更能感染Caco-2细胞和巨噬细胞样细胞，并在其中生长繁殖;培养LM于pH3.5下，可以获得耐酸的LM，它对鼠有较强的毒力，降低小鼠游离的中性粒细胞和巨噬细胞的免疫作用［37］;c.在富含铁的介质中，LM可通过增加内化素基因的表达来增强对Caco-2细胞的侵袭性;此外铁的获取也可影响ActA 蛋白的表达［38］。

另外，LM黏附蛋白(LAP)位于细菌表面和胞浆中，研究发现LAP缺陷性菌株对小肠的黏附较野生型明显降低［39］，推测LAP在LM肠道感染阶段可能起重要作用［40］。

2.7 内化素(Internalis，Inl)

内化素为内化素家族的一群蛋白质，包括InlA、InlB、InlC到InlH，其中InlA和InlB为最早鉴定出的与细菌侵袭相关的毒力因子［28］，为 LM 所特有［13］，由转录调控因子PrfA调节［41］。LM可直接进入吞噬细胞或通过内化素介导进入宿主细胞的吞噬囊泡，并能溶解宿主细胞的吞噬泡膜，逃离吞噬体，进入胞浆，在胞浆中复制繁殖及在细胞间传递。InlA有800个氨基酸，而InlB具有630个氨基酸。InlA是被认定的第一个LM表面蛋白，对于LM穿入非吞噬细胞如上皮细胞来说是必需的，InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要的作用，即InlA和InlB是LM被非吞噬细胞内化所必需。另外，小的分泌性亚族在体内对传染过程有明显影响。为了解Inl家族之间的关系，Bergman 等［42］构建了inlA、inlB、inlC、inlE、inlG、inlH的突变株，InlB依赖的内化不需要其他内化素的存在，而 InlA在缺少 InlB时内化要求 InlC和InlGHE的辅助，缺失inlGHE基因簇或者其中的任何一个，LM对微脉管内皮细胞HBMEC细胞系的内化能力都增强了2～4倍，缺少WB将完全不能侵袭HB-MEC，把这些相应的Inl突变株通过显微注射进Caco-2细胞显示，这些内化素似乎没有一个对LM的细胞间传播是必要的。inlB基因编码合成InlB，InlB失活会使单增李斯特菌毒力严重下降。Kaclikova［43］针对 inlB基因特异地扩增出 343bp片段，该片段成功地应用到了各种人工污染的食品中。

近年来，结合分子生物学、细胞生物学、生物化学、结构生物学和组织病理学等方面的技术，对LM的毒力因子已有比较深入的了解。一些新的毒力因子不断被发现，如重要性仅次于PrfA的VirR毒力调控因子、胆酸盐水解酶(BSH)、具有自溶作用的Auto蛋白、参与InlA和肽聚糖结合的分拣酶(Sortase)、酰胺酶(Ami)、纤连蛋白结合蛋白A(FbpA)、己糖磷酸盐转运蛋白(Hpt)、Vip等。随着新技术的发展及更完善动物模型的建立，对LM的毒力因子及其致病机理的研究将更加完善。

3 流行病学

LM被WHO列为4种主要的食源性病原菌之一［44］，在自然界中分布广泛，土壤、河水、污泥、青贮饲料中均可存在，也可寄生于蜱、蝇、昆虫、鱼及甲壳动物体内，还能存在于人和动物的胃肠道中。据报道，健康人类粪便中该菌的携带率为0.6%～16%，有20%的人可短期带菌，4%～8%的水产品、5%～10%的乳及其制品、30%以上的肉制品及15%以上的禽产品均被该菌污染。1983年美国马萨者塞洲发生巴氏消毒奶中毒事件，1985年美国加利福尼亚洲墨西哥式干酪中毒事件，1995年瑞士西部爆发了一起软质奶酪引起的中毒事件，在上述事件中，都在患者食物中发现单增李斯特氏菌(单增李斯特菌)。而2011年9月，美国发生了10多年来最严重的一起单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发事件。此次暴发涉及到美国24个州，通过流行病学、溯源和实验室调查后发现这起暴发与食用来自科罗拉多州的格兰纳达波尼地区的Jensen农场种植的香瓜相关。中国现已将食品中单增李斯特菌的监测纳入食品污染物监测网，随着对该菌的重视和检测技术的提高，食品中单增李斯特菌的检出率明显提高。本菌可通过眼及破损皮肤、黏膜进入人体而造成感染，孕妇感染该菌后出现类似流感症状，通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，并致流产;栖居于阴道、子宫颈也引起感染。兽医师及从事相关职业的人员易患皮肤型李斯特菌病。

4 展望

LM在自然界广泛存在，食品在贮藏加工过程中也很容易被污染，国内外近些年不断从食物中检出LM，李斯特菌病已成为仅次于沙门氏菌感染的第二号致命的食源性疾病。因此，LM的感染过程及其调控机理成为当前研究的重点，而感染过程中的每个阶段均由相应的毒力因子调控，近年来也探索发现了多种毒力因子，毒力因子的致病机制也被不断的发现。随着新技术的发展及更完善动物模型的建立，对LM的毒力因子及其致病机理的研究将更加完善，进而给LM的快速检测及其控制技术提供更有利的理论依据。

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