羟丙基-β-环糊精对百里香挥发油包合作用的研究

马君义，王宝生，黄玉龙，王曼婷，张 继

(1.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070;2.甘肃特色植物有效成分制品工程技术研究中心，甘肃兰州 730070)

百里香(Thymus mongolicus Ronn.)为唇形科百里香属多年生草本植物，是国际标准化组织1970年公布并被世界许多国家承认的食物香辛料之一，具有祛风解表、行气健脾、温中止痛、杀菌驱虫的功效。百里香兼有较高的食用、药用和化工应用价值，可作为肉酱、香肠、腌肉和泡菜的绿色无害的香料添加剂，同时还有香化、蜜源、绿化观赏和环保等作用，是一种开发潜力较大的芳香植物。百里香挥发油具有抗菌、消炎止痛、抗氧化、抗肿瘤、防止血栓形成、治疗关节炎以及减缓身体器官组织衰老等重要的药理作用［1－8］。但百里香挥发油性质不稳定，易挥发，易氧化变质，使其应用受到限制。国内已有多篇文献报道采用β－环糊精(β－CD)包合技术成功的制备了百里香挥发油β－CD包合物，包合后的百里香挥发油包合物可溶于水，稳定性提高，并提高了生物利用度［9－11］。但由于 β－CD 的水溶性较小，且具有溶血等不良反应，而羟丙基－β－环糊精(HP－β－CD)不仅水溶性高，增溶效果显著，且肾毒性、溶血作用及刺激性均较小［12］，被认为是极有潜力的低毒、安全、有效的增溶剂。本研究通过正交实验和综合评分对HP－β－CD包合百里香挥发油工艺进行优化，采用傅立叶变换红外光谱(FT－IR)对包合物进行表征，并利用气相色谱－质谱联用(GC－MS)技术对比分析了包合前后百里香挥发油的化学成分，为百里香挥发油的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

百里香 采自甘肃省临潭县，经西北师范大学植物研究所廉永善研究员鉴定为Thymus mongolicus Ronn;HP－β－CD 批号100304，山东新大精细化工有限公司;无水硫酸钠 沈阳化学试剂厂;无水乙醇

烟台市双双化工有限公司;无水乙醚 天津市德恩化学试剂有限公司;其他试剂 均为分析纯。

JRA－6型数显恒温磁力搅拌水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司;LGJ－18S冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;AL系列溶剂过滤器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司;挥发油提取器 华东医药器化有限公司;Focus GC－Polaris Q气相色谱－质谱联用仪 美国热电公司;Nicolet IS10型傅里叶变换红外光谱仪 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发油的制备

1.2.1.1 包合前挥发油的制备 称取经阴干且粉碎粒度≤1.0cm的百里香植株地上部分100g，加10倍量蒸馏水，浸泡12h，按照2010年版《中国药典(一部)》附录XD挥发油测定法提取挥发油，收集挥发油并经适量无水硫酸钠脱水，离心分离，得黏稠状淡黄色油状液体，冷藏备用。

1.2.1.2 包合后挥发油的制备 取包合物适量，加水溶解后，用水蒸气蒸馏法回提挥发油，收集挥发油并经适量无水硫酸钠脱水，离心分离，依下式计算挥发油空白回收率、利用率。

挥发油空白回收率(%)=收集的挥发油量(mL)/加入的挥发油量(mL)×100

挥发油利用率(%)=包含物中挥发油量(mL)/投油量(mL)×空白回收率×100

1.2.2 百里香挥发油HP－β－CD包合物的制备 称取一定量的HP－β－CD于三角烧瓶中，加蒸馏水适量，置于数显恒温磁力搅拌水浴锅中搅拌使其溶解。另取一定量的百里香挥发油，用等量无水乙醇溶解后边搅拌边缓慢滴入恒温的上述溶液中，继续搅拌一定时间后停止加热，使之搅拌并冷却至室温后，用0.45μm有机微孔滤膜抽滤，滤液在冰箱中预冻24h后，置冷冻干燥仪中冷冻干燥48h，得百里香挥发油的HP－β－CD包合物;包合物再用无水乙醚洗涤，除去表面残留的百里香挥发油，然后挥去无水乙醚并依下式计算包合物得率。

包含物得率(%)=包含物收得量(g)/(β－CD投入量(g)+挥发油投入量(g))×100

1.2.3 百里香挥发油HP－β－CD包合物制备工艺的正交实验设计 为探索HP－β－CD包合百里香挥发油的最佳工艺条件，根据预实验，以影响HP－β－CD包合百里香挥发油的主要因素:挥发油(mL)与HP－β－CD(g)的体积质量比(A)、包合温度(B)、搅拌时间(C)及HP－β－CD的浓度(D)为考察因素，以包合物得率和挥发油利用率为评价指标，根据各指标对实验结果的影响以及考虑到生产成本和包合效果，按权重系数分别为0.3和0.7进行综合评分(综合评分=包合物得率×0.3+挥发油利用率×0.7)，选用L9(34)正交表进行正交实验设计优化最佳工艺条件，实验设计的因素与水平见表1。

表1 百里香挥发油HP－β－CD包合工艺正交实验因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

1.2.4 包合前后百里香挥发油化学成分的GC－MS分析条件

1.2.4.1 气相色谱条件 色谱柱:TR－5MS弹性石英毛细管柱(30m ×0.25mm ×0.25μm);柱温:250℃;进样口温度:250℃;程序升温:从50℃开始，保持3min，以8℃/min的升温速率升至250℃，并保持2min;载气:高纯氦气;载气流速:1.0mL/min;载气模式:恒流模式;进样方式:分流进样;分流比1∶20。

1.2.4.2 质谱条件 传输线温度:270℃;电离方式:EI源;电子能量:70eV;离子源温度:250℃;质量扫描方式:全扫描;质量扫描范围:50～650amu;溶剂延迟:2min;质谱数据库:NIST2005版标准质谱检索库。

在上述分析条件下，取用无水乙醚稀释的包合前后的百里香挥发油各0.2μL进样分离，得总离子流图，经气相色谱处理机用面积归一化法从其总离子流图中计算各组分的百分含量，通过挥发油的GC－MS总离子流色谱检测，所得质谱图经NIST05版计算机质谱数据库检索并结合谱图解析，确定并比较包合前后百里香挥发油的化学成分。

1.2.5 百里香挥发油HP－β－CD包合物的FT－IR分析 分别取HP－β－CD、包合前后的百里香挥发油、百里香挥发油与HP－β－CD的物理混合物及其包合物适量，用KBr压片后于400～4000cm－1范围内进行红外吸收光谱扫描。

表2 HP－β－CD包合百里香挥发油工艺L9(34)正交实验结果Table2 Results of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

2 结果与分析

2.1 百里香挥发油HP－β－CD包合物制备工艺的正交实验

百里香挥发油HP－β－CD包合物制备工艺的正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表3 HP－β－CD包合百里香挥发油工艺L9(34)正交实验结果方差分析表Table3 Variance analysis of orthogonal test on inclusion of volatile oil with HP－β－CD

由表2直观分析可知，各因素对百里香挥发油包合效果影响的大小顺序为:B＞A＞C＞D。由表3方差分析可知，A、B、C三个因素各水平间有显著性差异，D因素3个水平间无显著性差异。因此，正交实验综合评分法优选出的百里香挥发油HP－β－CD包合物的最佳制备工艺条件为A3B1C2D1，即:百里香挥发油与 HP－β－CD 的体积质量比为1∶10(mL∶g)，包合温度30℃，搅拌时间2.5h，HP－β－CD的浓度5%。

2.2 百里香挥发油HP－β－CD包合物最佳制备工艺验证实验

根据正交实验结果，对优选出的最佳工艺条件A3B1C2D1进行验证实验，制备三批包合物，所得各评价指标稳定，百里香挥发油HP－β－CD包合物的平均得率为91.77%，平均挥发油利用率为81.94%，平均综合评分为85.82(见表4)，说明优选出的包合工艺稳定、可行。

2.3 包合前后百里香挥发油化学成分的GC－MS分析

图1 HP－β－CD包合前后百里香挥发油GC/MS总离子流色谱图Fig.1 Total ionic current chromatogram of volatile oil by GC－MS before and after being included by HP－β－CD

通过GC－MS联用技术分离分析，并用质谱图库进行计算机检索和面积归一化法计算，结果见图1和表5。百里香挥发油的主要化学成分为百里香酚、1－甲基－2－(1－异丙基)－苯、1－甲氧基－4－甲基－2－(1－异丙基)－苯、茨醇、石竹烯、石竹烯氧化物、1－甲基－4－(1－异丙基)－1，4－环己二烯等。由表5可知，HP－β－CD包合前后百里香挥发油的主要化学成分基本相同，但挥发油中各组分的组成比例发生了一定程度的改变，百里香酚、1－甲氧基－4－甲基－2－(1－异丙基)－苯所占比例有所降低，茨醇、1－甲基－4－(1－异丙基)－1，4－环己二烯所占比例有所增加，而1－甲基－2－(1－异丙基)－苯、顺式－1－甲基－4－(1－异丙基)－2－环己烯－1－醇分别转变为其同分异构体1，2，4，5－四甲基苯、桉叶醇，其他成分的变化程度也不尽相同，说明包合对百里香挥发油的化学成分的组成和比例略有影响［13－14］。

表4 百里香挥发油HP－β－CD包合最佳工艺验证实验结果Table4 Stability test on inclusion process of volatile oil with HP－β－CD

2.4 百里香挥发油 HP－β－CD包合物的 FT－IR分析

HP－β－CD、包合前后的百里香挥发油、百里香挥发油与HP－β－CD的物理混合物及其包合物的红外吸收光谱如图2所示。分析指纹区红外吸收光谱图，百里香挥发油在 1421、1252、1088、991、934、808cm－1处的吸收峰在包合物中均未出现，而HP－β－CD 在 1645、1459、1374、943、852cm－1处的吸收峰在物理混合物和包合物中同时出现，物理混合物的吸收峰在HP－β－CD和百里香挥发油的红外图谱中均可找到，说明百里香挥发油已被HP－β－CD所包合。相对包合前的百里香挥发油，包合后的百里香挥发油在 1628、1514、1172、636cm－1处产生了新的吸收峰，说明HP－β－CD包合对百里香挥发油的化学成分略有影响。

图2 各物质的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrum of all material

3 结论

正交实验与综合评分相结合优选的水溶液搅拌法制备百里香挥发油HP－β－CD包合物的最佳包合工艺条件为:百里香挥发油与HP－β－CD的体积质量比为1∶10(mL∶g)，包合温度 30℃，搅拌时间 2.5h，HP－β－CD的浓度5%，在此最佳工艺下，平均包合物得率、平均挥发油利用率、平均综合评分分别为91.77%、81.94%、85.82，该工艺合理、稳定、可行。

表5 HP－β－CD包合前后百里香挥发油主要化学成分的GC－MS对比分析Table5 Comparison analysis of main chemical components of volatile oil before and after being included by HP－β－CD through GC－MS

续表

GC－MS与FT－IR分析表明，百里香挥发油与HP－β－CD形成了包合物，包合前后百里香挥发油的主要化学成分基本相同，但挥发油中各组分的组成比例发生了一定程度的改变，包合对百里香挥发油的化学成分略有影响。

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