大孔吸附树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺优选

瞿 慧 曹 园* 方祝元 刘志辉

（南京中医药大学附属江苏省中医院，南京 210036）

大孔吸附树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺优选

瞿 慧 曹 园* 方祝元 刘志辉

（南京中医药大学附属江苏省中医院，南京 210036）

目的 优选大孔树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺条件。方法 以鬼针草总黄酮的吸附率和洗脱率为指标，通过静态吸附试验比较不同种大孔树脂对鬼针草总黄酮的吸附能力，筛选出合适的大孔树脂型号；通过单因素试验优选鬼针草总黄酮的纯化工艺参数。结果 HPD400型大孔树脂纯化效果最好，其最佳工艺参数为药液中质量浓度0.5 mg/mL，pH =4.0，吸附速率2 BV/h，用9 BV 60%乙醇洗脱，洗脱速率3 BV/h，经大孔树脂纯化后鬼针草提取液中总黄酮纯度由原来的24.47%提高至58.41%。结论 HPD400型大孔树脂适用于鬼针草总黄酮的纯化，优选的纯化工艺稳定可行。

鬼针草；总黄酮；大孔树脂

鬼针草药用历史悠久，始载于《本草拾遗》，全草入药，味苦而无毒，归肺、胃、大肠、胆经，具有清热解毒，活血散瘀消肿之功效，多用于疟疾、痢疾、肝炎、急性肾炎、咽喉肿痛、跌打损伤、蛇虫咬伤等[1]。近年来，鬼针草药材临床用于治疗原发性高血压、高胰岛素血症、糖尿病等，疗效确切[2-4]。其化学成分包括黄酮类、聚炔类、香豆素类、生物碱类、有机酸及其酯等，而黄酮类成分为其主要的活性成分[5-7]。本课题组前期的研究亦表明鬼针草含有丰富的黄酮类成分。本实验通过比较研究不同种树脂对鬼针草总黄酮吸附性能，筛选出较为适合的大孔树脂型号，并探索其分离纯化鬼针草总黄酮的工艺条件，为鬼针草的进一步开发利用提供参考和依据。

1 材 料

Cary50紫外分光光度计（Varian，美国），BP-211D型电子分析天平（Satorius Co.Ltd.，德国），WH-2震荡仪（上海泸西分析仪器），W5-100SP型恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）。

鬼针草采自南京东郊中山陵，经中国药科大学王强教授鉴定为菊科鬼针草属植物鬼针草（Bidens bipinnata L.）的干燥地上部分；对照品芦丁为实验室自制，结构经NMR数据及文献对比确证，HPLC-UV面积归一化法计算纯度在98%以上；水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯；AB-8树脂，天津南开大学化工厂；D101树脂，天津农药股份有限公司；HPD100、HPD400、HPD600树脂，河北沧州宝恩化工有限公司；SP825树脂，北京惠德易科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定[8-9]

精密称取芦丁对照品（120℃干燥至恒重）25.2 mg，置于50 mL量瓶中，加60%乙醇超声溶解，冷却至室温后定容至刻度，制成0.504 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加60% 乙醇10 mL，摇匀，加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀后静置6 min，加入4%氢氧化钠试液10.0 mL，并用60%乙醇定容至刻度，摇匀后静置15 min。同法配制空白对照液，按紫外-可见分光光度法，测定505 nm波长处的吸光度（A），以质量浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.0121C-0.0138，r=0.9996，表明芦丁在10.08～100.8 µg/mL范围内线性关系良好。

2.2 树脂类型的选择

2.2.1 树脂预处理：称取AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、D101、SP825型大孔树脂各50 g，分别用95%乙醇浸泡24h后湿法装柱，用95%乙醇洗涤，至流出液加5倍量水不浑浊为止，后用净水充分淋洗至无乙醇味；用2BV的5%HCL溶液，以4～6BV/h的流速洗涤，并浸泡2～4h，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。再用2BV的2%NaOH溶液，以4～6BV/h的流速洗涤，并浸泡2～4h，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。最终置于密闭容器中，备用[10]。

2.2.2 鬼针草总黄酮提取液的制备：取石油醚（60～90℃）脱脂后的鬼针草粗粉适量，以15倍药材量的60%乙醇进行回流提取，提取3次，每次1h，合并醇提液，滤过减压回收乙醇至无醇味，补充适量水一定体积，摇匀，备用。

2.2.3 静态吸附及洗脱试验：取处理后的AB-8、HPD100、HPD400、HPD600、D101、SP825型湿树脂（用滤纸吸干表面水）各5g，加至100mL具塞三角瓶中，加入1.875mg/mL鬼针草总黄酮提取液60mL，25℃恒温振荡24h，过滤，分别吸取各树脂吸附后药液6.0mL，按2.1项下方法于505nm处测定A，计算各树脂对鬼针草总黄酮的吸附率。将静态吸附后的树脂抽滤至不滴水为止，加入250mL具塞三角瓶中，于室温条件下加入75%乙醇100mL洗脱，25℃恒温振荡24h，过滤，分别吸取各洗脱液10.0mL，按2.1项下方法于505nm处测定A，计算各树脂对鬼针草总黄酮的洗脱率，结果见表1。

表1 6种大孔树脂对鬼针草总黄酮的吸附率与洗脱率

由表1可知，各种树脂对鬼针草总黄酮吸附能力的大小顺序为：HPD400＞HPD600＞D101＞SP825＞HPD100＞AB-8；洗脱率大小依次为：HPD400＞D101＞AB-8＞HPD100＞SP825＞HPD600，故选用HPD400作为鬼针草总黄酮纯化用树脂。计算公式如下[11]：

吸附率=（C0V0-C1V1）/C0V0

洗脱率=C2V2/（C0V0-C1V1）×100%

纯度=（m2/m1）×100%

式中C0表示起始提取液中总黄酮质量浓度，C1表示吸附24h后溶液中总黄酮质量浓度，C2表示洗脱液中总黄酮质量浓度，V1表示提取液体积，V2表示洗脱液体积，m1表示洗脱液干燥后固体的称样量，m2表示洗脱液中总黄酮的测定量。

2.3 HPD400型大孔吸附树脂纯化工艺优选

2.3.1 上样质量浓度考察：取已预处理的HPD400型吸附树脂6份，每份10g，湿法装柱（2.0cm×28.0cm），分别加入鬼针草总黄酮提取液0.1、0.3、0.5、0.7、1、1.5mg/mL，以2BV/h流速进行吸附，分别收集过柱液并记录体积，于505nm处测定A，计算吸附率分别为73.69%，76.85%，80.54%，62.71%，55.36%，43.67%。说明对于一定量的溶质来说，上样液浓度增大，树脂对溶质的物理吸附作用和化学吸附作用均增强，吸附效果也更好；但上样液浓度过高，导致吸附选择性降低、黄酮提早泄漏，所以必须选择适宜的上样浓度，确定为0.5mg/mL。

2.3.2 上样流速对吸附的影响：在上样液质量浓度0.5mg/mL，考察上样流速分别为1、2、3、4、5、6BV/h的影响，结果总黄酮吸附率分别为81.67%，79.54%，70.59%，60.97%，56.35%，43.55%。表明随着上样液流速的增加，HPD400型大孔树脂的吸附率下降。由于吸附与脱附是一个动态平衡过程，在一定的吸附速度下加快流速使吸附时间相对减少，泄露点提前，而流速太慢又耗时，故选定2BV/h。

2.3.3 上样液pH对吸附的影响：在上样液质量浓度0.5mg·mL-1和上样流速为2BV/h的条件下，考察上样液pH分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0时，HPD400型大孔树脂对鬼针草总黄酮吸附率的影响，结果分别为81.17%，88.78%，82.30%，80.47%，76.19%。说明酸性介质利于鬼针草总黄酮的吸附，因为其具有酚羟基，显弱酸性。但pH=3.0时不升反降，推测是黄酮类化合物形成钅羊盐而不易被吸附。故上样pH选定4.0。

2.3.4 上样量的考察：在上样液质量浓度0.5mg/mL，pH4，流速为2BV/h的条件下，考察树脂与生药量重量比为1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3时，HPD400型大孔树脂对鬼针草总黄酮的吸附率分别为82.60%，86.79%，88.53%，71.27%，57.86%，说明随着上样量的增大，树脂对总黄酮的吸附量也逐渐增大，但当树脂达到了饱和吸附时，继续增加上样量，就有黄酮泄露。因此，鬼针草提取液的最佳上样量（树脂∶生药量）为1∶1。

2.3.5 洗脱剂浓度的考察：按照树脂与生药量之比为1∶1加入上样液，药液浓度0.5mg/mL，上样速度为2BV/h，依次加水及体积分数30%、40%、50%、60%、75%、95%乙醇洗脱，分别洗至无色，收集各部分洗脱液，测定总黄酮纯度分别为40.49%、46.81%、53.22%、61.29%、47.01%、42.72%，总黄酮的洗脱率分别为57.72%、69.16%、81.13%、90.27%、80.05%、70.96%。说明随着乙醇体积分数的不断增加，总黄酮的解析率不断上升，而当体积分数＞60%，总黄酮的解析率反而有所下降，可能是因为乙醇浓度增加，黄酮的溶解性减弱，且洗脱的脂溶性杂质也增加。因此选用60%乙醇为洗脱剂较为适宜。

2.3.6 洗脱剂用量的考察：按照树脂与生药量之比为1∶1加入上样液，药液浓度0.5mg/mL，上样速度为2BV/h，依次加水及体积分数60%乙醇洗脱，每1.5BV收集1次，测定每次收集液中总黄酮质量浓度（图1）。结果当60%乙醇用量为9BV时，收集液中已基本检测不出总黄酮，因此60%乙醇用量选9BV。

图1 鬼针草总黄酮洗脱剂用量考察

2.3.7 解吸附流速的考察：采用60%乙醇为洗脱剂，考察洗脱速度分别为1、2、3、4、5BV/h对鬼针草总黄酮洗脱率的影响，结果分别为93.04%、91.75%、90.10%、76.52%、65.33%。说明随着洗脱流速的加快，总黄酮的洗脱率呈下降趋势。对于一定量的洗脱液，加快流速，会使洗脱液与树脂作用时间相对缩短，从而使解析率下降。但流速过慢，又会延长工作周期。因此选择洗脱剂流速3BV/h。

2.4 验证实验

取已预处理的HPD400型吸附树脂4份，每份10g，湿法装柱，将4份鬼针草提取液，每份30mL，调pH至4.0，分别加至树脂柱，按优选工艺进行试验，计算总黄酮质量浓度。结果吸附率分别为88.61%、87.26%、87.35%；洗脱率依次为91.13%、90.71%、92.20%。另取提取液、洗脱液各20mL，检测其中总黄酮的质量浓度。结果原鬼针草提取液中总黄酮的纯度为24.47%，3次验证试验总黄酮纯度分别为57.89%、58.26%、59.07%，经大孔树脂纯化后，总黄酮纯度提高了约33.94%，说明该工艺稳定，产品质量可控。

3 讨 论

通过静态吸附试验，比较了6种不同型号大孔树脂对鬼针草总黄酮的吸附性能，筛选出HPD400型大孔树脂为最佳鬼针草总黄酮分离纯化的大孔树脂。这是因为鬼针草总黄酮为黄酮苷元及苷的混合物，所以中等极性树脂HPD400的吸附性好，解析率也高。

在对HPD400型树脂动态吸附鬼针草总黄酮特性进行研究的基础上，确定HPD400型大孔树脂纯化鬼针草总黄酮的最佳工艺参数为上样质量浓度0.5mg/mL，pH 4.0，上样速率2BV/h；洗脱剂为60%乙醇，洗脱流速3BV/h，洗脱剂用量9BV。

由于鬼针草含有大量的叶绿素，故提取液经石油醚萃取后，再经过HPD400型大孔树脂纯化，可以获得更高纯度的鬼针草总黄酮，也利于树脂柱的再生和重复利用。

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Optimization of Purification Technology for Total Flavonoids in Bidens bipinnata by Macroporous Adsorption Resin

QU Hui, CAO Yuan*, FANG Zu-yuan, LIU Zhi-hui
(The Affiliated Jiangsu TCM Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210036, China)

Objective To optimize purification technology of total flavonoids in Bidens bipinnata by macroporous resin. Method With adsorption rate and desorption rate of total flavonoids as indexes, adsorption property of six different kinds of macroporous resins for total flavonoids in B. bipinnata was compared by static adsorption and desorption experiments, in order to select optimum macroporous resin. Single factor test was used to investigate adsorption and elution conditions of macroporous resin. Result HPD400 macroporous resin presented the best effect of purification. Its optimum purification parameters were as followings: the sample concentration 0.5 g/L,pH 4,sample flow rate 2 BV/h,eluted with 9 BV 60% ethanol at 3 BV/h. After purification by macroporous resin, purity of total flavonoids in ethanol extract of B. bipinnata would be increased from 24.47% to 62.33%. Conclusion HPD400 macroporous resin was among the most suitable one for purification of total flavonoids in B. bipinnata. Optimized purification technology was stable and feasible.

Bidens bipinnata; Total flavonoids; Macroporous resin; Purification

R944

B

1671-8194（2013）34-0067-03

江苏省科技厅社会发展项目（BE2009696）江苏省中医药局科技项目（LZ11002）

*通讯作者：E-mail：caoy2002@126.com.