凝胶法和动态浊度法在b型流感嗜血杆菌结合疫苗细菌内毒素控制中的应用比较

马 平 马国荣 吴菊寿 齐 娟 杜送田

（兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃 兰州 730046）

凝胶法和动态浊度法在b型流感嗜血杆菌结合疫苗细菌内毒素控制中的应用比较

马 平 马国荣 吴菊寿 齐 娟 杜送田

（兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃 兰州 730046）

目的 在b型流感嗜血杆菌结合疫苗生产过程中采用凝胶法和动态浊度法检测中间品、原液和成品中细菌内毒素含量，以此控制热原，提高制品质量，并对两种方法进行比较。方法 采用《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅻ E细菌内毒素检查法中的凝胶法和动态浊度法。结果 Hib中间品、原液及成品经凝胶法和动态浊度法测定，内毒素含量均＜25EU/µg、5EU/µg、25EU/剂，符合规定。结论 各项检定结果表明：应用动态浊度法和凝胶法检测b型流感嗜血杆菌结合疫苗中间品、原液和成品细菌内毒素含量结果相符，动态浊度法定量检测对于内毒素含量内控指标有很好的指导意义。

凝胶法；动态浊度法；b型流感嗜血杆菌结合疫苗

细菌内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热,是制药工业污染的主要因素，因此细菌内毒素检查（BET）是药品质量控制中的一项重要指标[1]。因此，生物制品必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。为保证b型流感嗜血杆菌结合疫苗质量，在生产过程和成品检定中，使用凝胶法来判定产品内毒素检测是否合格，用动态浊度法来定量细菌内毒素含量，以此来确定该制品细菌内毒素内控标准限值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂：细菌内毒素工作标准品：中国食品药品检定研究院，批号：200965。凝胶法鲎试剂湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.25EU/ mL，批号：120971。动态浊度法鲎试剂湛江安度斯生物有限公司，批号：1208102。细菌内毒素检查用水湛江安度斯生物有限公司，批号：1304260。

1.1.2 设备：BET-32M，天津市天大天发科技有限公司；HH·W21-420BS数显电热恒温水温箱，上海科恒。

1.1.3 供试品：精制b型流感嗜血杆菌结合疫苗荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗成品，均有兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗三室生产。

1.2 方法

1.2.1 内毒素限值的确定：根据《中华人民共和国药典》（2010年版）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）按以下公式确定：L=K/ M，式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/mL表示。K为人每千克体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5EU/（kg·h）。M为人用每千克体质量每小时的最大供试品剂量，以mL/（kg·h）表示。

1.2.2 确定最大有效稀释倍数（MVD）：指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数。用以下公式计算：MVD=cL/λ，式中L为供试品的细菌内毒素限值，c为供试品溶液的浓度。λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/mL）或在动态浊度法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

1.2.3 凝胶法：鲎试剂灵敏度复核：取细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解后制成2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，取复溶后的0.1mL/支规格的鲎试剂10支，将其中8管排成4列，每列2管，分别加入2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另外2管加入0.1mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照。观察并记录结果。干扰试验用Hib精制多糖、原液、成品各3批进行。凝胶限度试验：按表1制备溶液A、B、C、D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表1 凝胶限度试验

1.2.4 动态浊度法：标准曲线可靠性试验：用细菌内毒素检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，混合30 min，然后逐级稀释至内毒素为EU/mL的至少3个浓度的稀释液，取以上标准品液各0.1mL分别加入预先加有0.1mL鲎试剂的反应管内，混合均匀，同时做2支阴性对照管。供试品动态浊度法定量测定：将Hib精多糖溶解为1µg/mL的溶液，原液稀释至多糖含量为1µg/mL，成品直接测定。

2 结 果

2.1 内毒素限值的确定：根据《中华人民共和国药典》（2010 年版）中有关b型流感嗜血杆菌结合疫苗细菌内毒素的规定，精多糖细菌内毒素应不高于25EU/µg，原液细菌内毒素应不高于5EU/µg，成品细菌内毒素每1次人用剂量应不高于25EU。

2.2 确定最大有效稀释倍数（MVD）

2.3 鲎试剂灵敏度复核：阴性对照管结果为阴性，实验有效。λc=0.25EU/mL，在0.5λ-2λ即0.125和0.5EU/mL之间，可用于细菌内毒素检查，并以标识灵敏度λ=0.25EU/mL为该批鲎试剂的灵敏度。结果显示该鲎试剂灵敏度符合要求。

2.4 干扰试验：结果见表2。溶液A和阴性对照D的所有平行管都为阴性，并且C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内，结果显示三批多糖、原液、成品中均无对试验造成干扰的物质，试验有效。

2.5 凝胶限度试验：阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。

表2 干扰试验（凝胶法）

2.6 动态浊度法标准曲线的可靠性试验：标准曲线：lgT=2.9877+（-0.32011 lgC），|r|=0.9924＞0.9800。阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，变异系数CV%＜10%，试验有效。

2.7 干扰试验：部分结果见表3。λm=0.25EU/mL，供试品以3个稀释度进行干扰试验，变异系数均＜10%，回收率在50%～200%之间，符合药典规定，在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。供试品在100倍稀释情况下，回收率最接近100%，选择此稀释倍数为供试品检查法时的稀释倍数。

稀释倍数 外加内毒素 EU/mL 反应时间 s 变异系数 cv 回收率rc（%）实测内毒素 EU/mL 原液含量 EU/mL

表3 干扰试验（动态浊度法）

2.8 供试品内毒素含量定量检测：标准曲线：lgT=2.97747+（-0.177667：lgC）相关系数：|r|=0.9985＞0.980，符合规定。Hib精多糖内毒素含量均＜25EU/µg，原液内毒素内毒素含量均小5EU/µg及成品内毒素均＜25EU/剂。结果见表4。

表4 b型流感嗜血杆菌结合疫苗细菌内毒素测定结果比较

3 讨 论

细菌内毒素检查法是用鲎试剂与细菌内毒素产生凝聚反应的机制，以判断供试品中细菌内毒素是 否符合规定的一种方法。该法与热原法比较具有灵敏度高、重现性好、标准化实验过程短，且可完成多批次供试品检测等优点[2]。供试品用两种方法检测，结果相符，均小于内毒素限值，细菌内毒素试验凝胶定性法与动态浊度定量法，都是药典规定的方法，凝胶定性法只能判定结果是否符合法规要求，而动态浊度定量法可以可以测出产品中细菌内毒素含量，以此作为参考，可以不断提高产品细菌内毒素企业内控标准，保证产品质量。

[1] 王思理,胡冠时,贡立青.细菌内毒素检查法及其应用[M].北京:气象出版社,2002:38-81.

[2] 王璐,张红宇,刘勤.凝胶法和光度法测定灯盏花素注射液中细菌内毒素的含量[J].昆明医学院学报,2010,31(2):39-43.

Comparison of Gel-clot Test and Kinetic Turbidinetric Method Application in the Control of Bacterial Endotoxin in Hib

MA Ping, MA Guo-rong, WU Ju-shou, QI Juan, DU Song-tian
(Lanzhou Institute of Biological Products Co.Ltd, Lanzhou 730046, China)

Objective To detect the content of bacterial endotoxin in the intermediate, final bulk and finishied products of haemophilus type B conjugate vaccine with Kinetic turbidinetric method and gel clot test for the control of pyrogen and improving the quality of the products .Meanwhile compare with two methods. Method According to the Methods of Detection of Bacterial Endotoxin in the AppendixⅫE of The Pharmacopoeia of the People’s Republic of China of the year 2010 edition.Results The detection limit for acterial endotoxin of the intermediate,final bulk and finishied products of Hib defined 25EU/µg、5 EU/µg、25 EU/dose,in accordance with the provisions. Conclusion The results of the tests indicate that application of kinetic turbidinetric method and gel clot test for detection of Haemophilus influenza type B conjugates vaccine intermediates,final bulk and finished products in accordance with the results of the content of bacterial endotoxin,quantitative Kinetic turbidinetric method is a good guidance for endotoxin content of internal control index.

Gel-clot test; Kinetic turbidinetric method; Haemophilus type B conjugate vaccine

R927

B

1671-8194（2013）34-0017-03