戴氏绿僵菌变种拮抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用
2013-07-06张孝彬陈玉燕杨艳红
余 瑛，张孝彬，陈玉燕，杨艳红
(重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054)
虫草是一类复型真菌，其无性型产生的次级代谢产物具有抗菌、抗病毒、抗癌、杀虫、调节机体免疫、抗氧化［1］等作用，在医药领域有很大的应用潜力。戴氏绿僵菌变种Metarhizium taii var.chongqingensis nov(M.taii var)是一种低海拔地区虫草的无性型菌株。本文报道了M.taii var发酵产物拮抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的初步研究结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
供试菌:M.taii var，由重庆理工大学杨艳红分离保存。
病原菌:MRSA标准菌株WHO2、临床分离的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)共10株，由第三军医大学西南医院惠赠。
1.1.2 培养基
1)PDA固体培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂 15 g，pH=7.0，去离子水定容至 1 000 mL。
2)细菌培养基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g，氯化钠 5 g，Ph=7.0，去离子水定容至 1 000 mL。
3)抑菌平板培养基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g、氯化钠5 g，琼脂30 g，去离子水定容至1 000 mL。
4)生长发酵培养基:NaNO30.5 g，KCl 0.5 g，蔗糖 30 g，蚕蛹粉 0.5 g，pH=6.5，去离子水定容至1 000 mL。
5)发酵培养基:葡萄糖10 g，蛋白胨2.5 g，酵母粉 5 g，pH 值为 6.0 ～7.0，去离子水定容至1 000 mL。
1.1.3 主要试剂
蛋白酶K，购自鼎国生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 供试菌种的活化
取-80℃冰箱保存的供试菌 M.taii var，在PDA平板上划线接种，于28℃培养14 d至孢子发育成熟。
1.2.2 供试菌的发酵培养
孢子悬液的制备:从PDA平板上刮取孢子，用无菌水重悬成孢子悬液后以4层无菌擦镜纸过滤孢子液，血球计数板计数孢子，并调整孢子悬液浓度为109cell/mL。
接种及发酵:取100 μL孢子悬液接种到100 mL生长培养基中。培养2 d后，按1∶10接种至发酵培养基中。发酵培养条件优化应用正交设计法，采用2组变量:发酵培养基 pH 值为5.5、6.0、6.5、7.0;培养温度为 25℃、28℃、30℃。发酵培养3～9 d，每日取发酵上清2 mL，10 000 r/min离心5 min，取上清进行抗WHO2的活性测定。
1.2.3 病原菌的培养
挑取活化的WHO2或各临床分离的SA单克隆分别接种于 100 mL细菌培养基，37℃，250 r/min过夜培养，备用。
1.2.4 抑菌活性测定
M.taii var发酵上清拮抗WHO2的活性测定采用琼脂扩散法［2］。将过夜培养的 WHO2，用血球计数板计数调整浓度为104个/mL，用移液枪吸取100 μL菌液，均匀涂布到抑菌平板培养基上。用打孔器在培养基上打孔，孔中加入发酵上清液150 μL，于37℃恒温培养箱中放置培养12 h，测定抑菌圈直径大小。
临床分离的SA对甲氧西林敏感性测定结果由西南医院提供。SA对M.taii var发酵上清的敏感性采用琼脂扩散法测定。
1.2.5 高温及蛋白酶K对M.taii var发酵上清活性的影响
将发酵液上清分别在45℃、65℃、85℃、100℃各处理5 min、10 min、15 min，测定抑菌活性。用未经高温处理的发酵液上清作对照。
分别在100 μL发酵液上清中加入质量体积分数为10 mg/mL蛋白酶 K 50μL，37℃各孵育30 min、60 min，测定抑菌活性。用未加入蛋白酶 K发酵液上清作对照。
2 结果与分析
2.1 发酵温度及pH对M.taii var发酵上清抗菌活性成分表达的影响
在前期已对培养基进行筛选的基础上，采用不同pH的发酵培养基和发酵温度进行培养，提取发酵上清测定抑菌活性，结果(见表1)表明:30℃，pH值为5.5～6.0条件最适合抑菌成分的表达，该条件下发酵上清的抑菌活性最先达到峰值，即发酵7 d时抑菌圈直径达到3.6 cm，其活性高于其他条件下的发酵上清。
表1 不同培养温度、pH条件下M.taii var发酵上清拮抗MRSA的活性
2.2 高温对M.taii var发酵上清抗菌活性的影响
将M.taii var发酵上清分别用45℃、65℃、85℃、100℃处理后，测定其抑菌活性变化，结果显示:不同温度处理后 M.taii var发酵上清拮抗WHO2的抑菌圈直径无显著变化(见图1)，即M.taii var发酵上清中的抑菌成分在高温条件下活性稳定。
2.3 蛋白酶K对M.taii var发酵上清抗菌活性的影响
在M.taii var发酵上清中加入蛋白酶K，37℃孵育30 min或60 min后测定其抑菌活性变化，结果显示:处理后的M.taii var发酵上清拮抗WHO2的抑菌圈大小无显著变化(见图2)，即蛋白酶K对M.taii var发酵上清中的抑菌成分活性无影响。
2.4 M.taii var发酵上清对各临床分离SA的拮抗作用
测定M.taii var发酵上清对各临床分离SA的抗菌活性，结果显示该发酵上清对临床分离的SA菌株均有拮抗作用，其抑菌圈直径在3.4～3.6 cm(表2未显示)，这些被检测的SA中有对甲氧西林耐受菌株即MRSA菌株，也有对甲氧西林敏感的SA菌株(见表2)。
图1 M.taii var抑菌成分在高温处理后的稳定性
表2 M.taii var发酵上清对临床分离SA的抗菌活性
图2 M.taii var发酵上清抑菌成分经蛋白酶K消化后的活性
3 讨论
SA是引起细菌性食物中毒和化脓感染最常见的病原菌之一。自19世纪40年代青霉素问世以来，SA引起的感染性疾病受到较大的控制。但随着青霉素的广泛使用，有些SA产生了一种能水解β-内酰胺环的酶，可使青霉素无效，即产生了耐药性。随后推出的甲氧西林在临床使用2年后就出现了耐甲氧西林的菌株MRSA［3］。目前，MRSA已成为院内感染的重要病原菌之一。耐药菌株的不断出现，使得MRSA治疗药物变得日益匮乏，寻找新的抗MRSA活性物质来源是进行新型抗MRSA药物研发的工作基础。本研究研究证实M.taii var发酵上清对临床分离的不同MRSA菌株及普通SA菌株都有抗菌活性，表明M.taii var产生的抗菌成分与甲氧西林有不同的抗菌机制，该活性物该抗菌成分还有耐高温和抗蛋白酶K水解的特性，在pH值为5.6～6.0，温度为30℃时表达活性最高。已有的研究结果显示绿僵菌、白僵菌等真菌的次生代谢产物中含有一种结构为环肽的绿僵菌素(destruxins，Dtxs)［4-5］，具有抗菌、抗虫、抗肿瘤、抗炎症、抗骨质疏松、免疫抑制等多种活性［6］，Dtxs结构均由一个α-羟酸和5个氨基酸残基构成，不同菌株来源的Dtxs的α-羟酸类型、N-甲基化修饰、氨基酸侧链基团有所不同，均有耐高温、抗蛋白酶水解的特性［7］。M.taii var抗MRSA是否含有与先前报道的DTXs类似的结构仍需进一步研究。
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