丹红注射液对脑缺血再灌注后凋亡诱导因子（AIF）表达及神经元凋亡的影响

罗德云

（攸县中医院，湖南 株洲 412300）

丹红注射液对脑缺血再灌注后凋亡诱导因子（AIF）表达及神经元凋亡的影响

罗德云

（攸县中医院，湖南 株洲 412300）

目的 探究丹红注射液对脑缺血再灌注后凋亡诱导因子（AIF）表达及神经元凋亡的影响。方法 将21只Wistar大鼠随机分成三组：甲、乙、丙，其中甲组为假手术组，乙组为局灶性脑缺血再灌注组，丙组则为丹红注射液治疗组，之后采用改良线栓法来建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，甲乙丙三组都在1、3、5d之后对大鼠脑组织进行AIF及神经元凋亡变化的测定。结果 丙组大鼠脑组织AIF及神经元的凋亡在造模后的1、3、5d都明显要低于甲乙组（P＜0.05），可见差异具有统计学意义。结论 本研究显示，利用丹红注射液能有效抑制AIF的表达，从而减少神经元的凋亡，由此可见其对于大鼠脑缺血再灌注有着积极的保护作用。

丹红注射液；脑缺血再灌注；凋亡诱导因子；AIF；神经元凋亡

目前，严重危害人类健康的疾病中有一种缺血性脑血管病，而脑缺血损伤病理生理过程十分复杂，当前依然在不断探索之中[1]。随着科技不断进步，再灌注损伤导致的神经元凋亡已普遍受到了广泛关注，而如何减少再灌注损伤也成为了治疗急性缺血性卒中的重要工作。本研究以Wistar大鼠作为研究对象，进行了丹红注射液对脑缺血再灌注后凋亡诱导因子（AIF）表达及神经元凋亡的影响的研究，取得了良好的效果。现将相关结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 资本资料

实验动物：21只Wistar大鼠，体质量在250～330g，平均为275.9g；年龄在3～4个月间，平均为3.4个月。全部由我省总医院实验动物中心所提供，大鼠之间的一般资料差异性不大，因此具有可比性。药物与试剂：丹红注射液、AIF兔多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒。

1.2 基本方法

随机将21只Wistar大鼠随机分成三组：甲、乙、丙，其中甲组为假手术组，乙组为局灶性脑缺血再灌注组，丙组则为丹红注射液治疗组。丙组给予丹红注射液5mL/kg，在手术之前30min进行腹腔注射，每日进行一次，连续注射5d。乙组则给予等量的生理盐水。

1.3 动物建模

模型制作参照Nagasawa等[2]的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型。采用水合氯醛腹腔对大鼠进行注射麻醉，将其采用仰卧固定，分离其右侧的颈总动脉、颈内动脉与颈外动脉，同时将其颈总动脉与颈外动脉结扎，利用动脉夹夹闭颈总动脉，迅速在颈内动脉和颈外动脉分叉的下方剪一个切口，利用预先烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉（深度控制在18.55毫米左右），当有轻微阻力感，便可实现大脑中动脉阻塞以此形成脑缺血。之后，做好相关后续工作，比如结扎与缝合等。

1.4 AIF免疫组化标记

AIF免疫组化标记采用的是SABC法：将石蜡切片脱蜡至水，之后放进柠檬酸盐缓冲液中，用微波热进行修复15min左右，将其利用浓度为3%的双氧水进行室温孵育10min，进而利用浓度为10%的山羊血清封闭，再进行室温孵育10min，然后将血清倾去（不洗），滴加1∶200的兔抗鼠AIF抗体，在4℃的冰箱里过夜孵育，之后进行37℃复温1h，滴加适量的生物素将羊抗兔二抗工作液进行标记，采用37℃孵育15min。除封闭血清外，其余步骤皆采用PBS冲洗3次，每次5min左右。之后获得相关树胶封片，利用显微镜进行观察分析。最后根据TUNEL试剂盒提供的相关试验步骤进行操作，以对凋亡细胞进行检测，从而获取本研究所需相关数据结果。

1.5 统计学方法

本研究相关数据采用SPSS.12.0统计学软件进行相关统计与分析，相关数据采用均数及标准差（）表示，并采用t检验来检测差异性，以P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 AIF表达

AIF阳性细胞呈现出的是棕黄色，在甲组中并为见到明显的AIF阳性细胞；乙组与丙组在缺血再灌注1d后，皆呈现出了阳性细胞高峰（但差异性显著，详见表1），之后下降；通过统计学分析，可知乙组与丙组在同等时间内差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 乙组与丙组大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞表达对比（）

表1 乙组与丙组大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞表达对比（）

组别例数I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙组7125.36±9.0783.23±8.8953.89±6.12丙组792.90±7.4975.01±7.3647.06±5.87 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.2 凋亡细胞检测

TUNEL检测凋亡细胞，其荧光显微镜显示为绿色，DAB显色之后，出现了棕黄色颗粒者则为凋亡细胞，而正常的细胞核则无着色，主要存在缺血周围区，而甲组没见到明显的阳性细胞；乙组与丙组在缺血再灌注1d后，TUNEL凋亡细胞达到了高峰（存在明显的差异性，详见表2），之后下降；乙组与丙组进行对比分析可知，在同等时间内差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

神经元的凋亡在脑缺血再灌注继发的神经损伤机制中有着十分重要的作用，因此利用神经元凋亡的抑制来防治脑缺血再灌注继发神经元损伤已经成为了当下研究的一大热点。总的来说，细胞的凋亡属于一个十分复杂的过程，涉及到了酸中毒、能量衰竭、细胞内钙离子的超载等。AIF属于这些年才发现的一类凋亡效应分子，属于一种进化较为保守的黄素蛋白，一般在细胞线粒体膜间隙中，有着凋亡诱导的活性。AIF属于双功能蛋白，有着氧化还原酶的活性，同时也与线粒体的相关生理活动有着莫大的关联[3]。而丹红注射液属于当前最为常见的临床药物，主要成为包括了、红花黄色素与丹参等，采用的是中药红花与丹参科学提取精炼而成。本研究显示，利用丹红注射液能有效抑制AIF的表达，从而减少神经元的凋亡，由此可见其对于大鼠脑缺血再灌注有着积极的保护作用。

表2 乙组与丙组在大鼠缺血关注后的TUNEL凋亡细胞对比（）

表2 乙组与丙组在大鼠缺血关注后的TUNEL凋亡细胞对比（）

组别例数I/R 1dI/R 3dI/R 5d乙组7102.44±9.1377.10±8.0945.79±5.62丙组781.68±8.5767.59±5.7940.59±4.35 P值＜0.05＜0.05＜0.05

[1] 王彦平,杨金升,石向群,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注后凋亡诱导因子的表达与神经元凋亡的关系[J].中华神经医学杂志,2010, 9(6):263-264.

[2] 王彦平,杨金升,范磊.丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注后凋亡诱导因子的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2010,8(6):412-413.

[3] Chen ZQ,Hong L,Wang H.Effect of danhong injection on platelet activation and inflammatory factors in patients of acute coronary syndrome after intervention therapy[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009,29(8):692-294.

[4] 王彦平,杨金升,范磊.艾芬地尔对脑缺血再灌注大鼠AIF表达及神经元凋亡的影响[J].卒中与神经疾病,2010,17(2):315-316.

R743

B

1671-8194（2013）19-0097-02