桉叶油对体外培养人绒毛膜细胞增殖的影响

向 涛，李小燕，余永莉，程 秦，许本宏，张亚玲，李啸红

(1珠海市金湾区计划生育服务站，广东珠海519041;2遵义医学院珠海校区)

桉树在我国西南部和南部种植广泛、资源丰富，是民间常用的中草药。桉叶油(Eucalyptus)是自桉叶中提取的具有挥发性的物质，主要化学成分是萜类、萜醇、醚、酮类和酯等含氧化合物，其药理作用包括抗菌［1～3］、抗氧化［4～7］、抗炎［8，9］、促渗［10，11］、杀虫驱蚊［12～15］及防腐。研究显示，无明显细胞毒性作用剂量的桉叶油可影响乳腺癌细胞株MCF-7细胞孕激素受体表达，但其机理文献鲜见相关报道。本研究观察了桉叶油对体外培养人绒毛膜细胞增殖的影响，旨在为其在食品添加及药品开发中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 健康妇女孕6～8周新鲜人工流产的绒毛组织，实验时用0．25%胰酶消化，200目筛网过滤后离心收集细胞，加入适量含有20%小牛血清的DMEM培养液备用;桉叶油(桉叶素99．5%)购自德信行(珠海)香精香料有限公司，批号H071126。

1．2 人绒毛膜细胞分组及处理 取上述人绒毛膜细胞随机分为对照组和桉叶油组，均用含有20%小牛血清的DMEM培养液稀释后接种于细胞培养板，其中桉叶油组加入不同质量浓度的桉叶油，使终质量浓度分别为 0．75、0．15、0．015、0．001 5 mg/mL;对照组加入70%乙醇10μL/mL。

1．3 人绒毛膜细胞增殖情况测定 采用台盼蓝染色，每12 h计数一次活细胞，连续计数48 h，绘制细胞生长曲线;桉叶油处理后12、24、36 h以MTT法测定细胞增殖抑制率，12、24 h时同时以流式细胞仪测定细胞周期和凋亡情况。

1．4 统计学方法 采用SPSS15．0统计软件。计量数据以±s表示，两均数比较行t检验。P≤0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 桉叶油对人绒毛膜游离细胞生长的影响 随培养时间延长，两组人绒毛膜细胞数量均逐渐减少，其中0．75 mg/mL桉叶油组人绒毛膜细胞生长明显受抑，与对照组相比P＜0．05;其余桉叶油各组对绒毛膜细胞生长的影响与对照组相比，P＞0．05(见图1)。

图1 桉叶油对人绒毛膜细胞生长的影响

2．2 桉叶油对人绒毛膜细胞的增殖抑制效应0．75 mg/mL桉叶油组人绒毛膜细胞增殖抑制率与对照组相比 P ＜ 0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉叶油组人绒毛膜细胞增殖抑制率与对照组相比P＞0．05。详见表 1。

表1 两组人绒毛膜细胞增殖抑制率比较(%±s)

表1 两组人绒毛膜细胞增殖抑制率比较(%±s)

注:与同时间对照组比较，*P＜0．05

组别 细胞增殖抑制率12 h 24 h 36 h桉叶油组0．0015 mg/mL 4．31 ±11．51 －5．83 ±10．58 4．73 ± 8．31 0．015 mg/mL －2．99 ±10．10 －7．06 ± 9．64 4．41 ± 8．00 0．15 mg/mL 9．15 ±14．61 10．42 ±11．38 7．10 ±11．10 0．75 mg/mL 53．49 ±11．89* 78．50 ±18．43*95．55 ± 3．54*对照组8．65 ± 3．24 7．33 ± 7．21 6．24 ± 4．35

2．3 桉叶油对人绒毛膜细胞周期及凋亡率的影响

桉叶油作用12 h后，0．75 mg/mL桉叶油组G0～G1期细胞减少、S期细胞增多、G2～M期细胞减少、凋亡率明显增高，与对照组相比，P＜0．05;0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉叶油组 G0～G1期、G2～M期细胞比例与对照组相比P＜0．05，S期细胞比例及凋亡率与对照组相比P＞0．05(详见表2)。桉叶油作用24 h后，0．75 mg/mL桉叶油组G0～G1期细胞比例减少、S期细胞比例减少、G2～M期细胞比例增多、凋亡率升高，与对照组相比P＜0．05;与对照组相比，0．15、0．015、0．001 5 mg/mL 桉叶油组 S 期细胞比例均显著升高(P均＜0．05)，G2～M期细胞比例及凋亡率均无明显变化(P均＞0．05)，详见表3。

表2 实验12 h两组人绒毛膜细胞的细胞周期及凋亡率比较(%¯ ±s)

表2 实验12 h两组人绒毛膜细胞的细胞周期及凋亡率比较(%¯ ±s)

注:与对照组比较，*P ＜0．05

组别 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉叶油组0．001 5 mg/mL 55．23 ±1．84* 31．64 ±4．19 8．09 ±2．94* 26．71 ±5．61 0．015 mg/mL 57．32 ±1．58* 27．26 ±0．83 15．96 ±1．86* 26．70 ±1．65 0．15 mg/mL 49．23 ±1．95* 27．19 ±2．18 23．44 ±2．83* 23．27 ±1．07 0．75 mg/mL 19．79 ±1．52* 63．58 ±1．66*16．50 ±1．84* 33．60 ±1．74*对照组 41．28 ±1．48 29．52 ±1．97 28．99 ±1．92 25．43 ±1．94

表3 实验24 h两组人绒毛膜细胞的细胞周期及凋亡率比较(% ±s)

表3 实验24 h两组人绒毛膜细胞的细胞周期及凋亡率比较(% ±s)

注:与对照组比较，*P ＜0．05

组别 G0～G1 S G2～M 凋亡率桉叶油组0．001 5 mg/mL29．32 ±11．06* 50．70 ±2．46* 30．92 ±1．16 17．59 ±1．36 0．015 mg/mL 43．43 ±1．11* 38．73 ±2．05* 22．97 ±3．84 17．80 ±2．47 0．15 mg/mL 30．73 ±4．01* 38．09 ±2．18* 31．24 ±1．04 13．63 ±1．59 0．75 mg/mL 23．39 ±2．16* 28．77 ±1．54* 47．50 ±2．35* 57．14 ±2．28*对照组 58．48 ±1．43 13．08 ±1．99 28．57 ±0．92 13．45 ±2．36

3 讨论

目前，桉叶油已成为医药、香料和化学工业的重要原料及常用食品添加剂，尤其广泛用于皮肤用药制剂中。但我们的前期研究发现，桉叶油400 mg/kg对小鼠无遗传毒性，可降低环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率和精子畸形率;300 mg/kg的桉叶油对大鼠无胚胎毒性，对环磷酰胺诱发的胚胎畸形有拮抗作用，对孕鼠血清雌孕激素水平有一定影响［16］。

在胚胎发育过程中，绒毛膜细胞的生长状况和分泌活动起至关重要的作用。为进一步探讨上述现象发生的机制，本研究观察了桉叶油对体外培养的人绒毛膜细胞增殖的影响。结果显示:①随培养时间延长，两组人绒毛膜细胞数量均逐渐减少，其中0．75 mg/mL桉叶油组人绒毛膜细胞生长明显受抑，与对照组相比有显著差异;其余桉叶油各组绒毛膜细胞生长情况与对照组相比无显著差异。②0．75 mg/mL桉叶油组人绒毛膜细胞增殖抑制率显著高于对照组，其余桉叶油各组人绒毛膜细胞增殖抑制率与对照组相比无显著差异。③桉叶油作用12 h后，0．75 mg/mL桉叶油组G0～G1期细胞减少、S期细胞增多、G2～M期细胞减少、凋亡率明显增高，与对照组相比有显著差异;其余桉叶油各组G0～G1期、G2～M期细胞比例与对照组相比有显著差异，S期细胞比例及凋亡率无显著差异。桉叶油作用24 h后，与对照组相比，0．75 mg/mL桉叶油组G0～G1期细胞比例减少、S期细胞比例减少、G2～M期细胞比例增多、凋亡率升高;其余桉叶油各组S期细胞比例均显著升高，G2～M期细胞比例及凋亡率均无明显变化。提示0．75 mg/mL桉叶油对绒毛膜细胞生长有明显抑制作用和细胞毒作用，可显著影响绒毛膜细胞周期、诱导绒毛膜细胞凋亡;而 0．15、0．015、0．001 5 mg/mL桉叶油对绒毛膜细胞生长无明显抑制作用和细胞毒作用，也无诱导绒毛膜细胞凋亡的作用，但对绒毛膜细胞的细胞周期有影响。上述结果证实，美国食品香料制造协会(FEMA)规定的桉叶油在食品中的最高参考量剂量范围是安全的;无毒副作用剂量范围内桉叶油对绒毛膜细胞的生长有影响，此影响可能是通过影响细胞周期来实现，但影响细胞周期的具体机理及对绒毛膜细胞的分泌功能有无影响均有待进一步研究。

综上所述，质量浓度≤0．15 mg/mL的桉叶油对人绒毛膜细胞无明显生长抑制、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，但可影响细胞周期，且此影响可能随作用时间不同而异;此为桉叶油在食品添加及药物开发中的应用提供了实验依据。

［1］Ramezani H，Singh HP，Batish DR，et al．Antifungal activity of the volatile oil of Eucalyptus citriodora［J］．Fitoterapia，2002，73(3):26-262．

［2］Burt S．Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods--a review［J］．Int J Food Microbiol，2004，94(3):223-253．

［3］Cimanga K，Kambu K，Tona L，et al．Correlation between chemical composition and antibacterial activity of essential oils of some aromatic medicinal plants growing in the Democratic Republic of Congo［J］．JEthnopharmacol，2002，79(2):213-220．

［4］Grassmann J，Hippeli S，Dornisch K．Antioxidant properties of essential oils．Possible explanations for their anti-inflammatory effects［J］．Arzneimittelforschung，2000，50(2):135-139．

［5］Silva J，Abebe W，Sousa SM，et al．Analgesic and anti-inflammatory effects of essentialoils of Eucalyptus［J］．J Ethnopharmacol，2003，89(2-3):277-283．

［6］El-Ghorab AH，El-Massry KF，Marx F，et al．Antioxidant activity of Egyptian Eucalyptus camaldulensis var．brevirostris leaf extracts［J］．Nahrung，2003，47(1):41-45．

［7］DessíMA，Deiana M，Rosa A，et al．Antioxidant activity of extracts from plants growing in Sardinia［J］．Phytother Res，2001，15(6):511-518．

［8］吕小琴，唐法娣，王砚．蓝桉油对脂多糖引起的大支气管炎及黏蛋白高分泌的影响［J］．中国中药杂志，2004，29(2):168-171．

［9］宋立人．现代中药大辞典［M］．北京:人民卫生出版社，2001:1670．

［10］陈彩莲，姚梅坤．桉叶油和氮酮促透作用比较［J］．武警医学，2001，12(3):171-172．

［11］江川，黄玉芳，姚梅坤，等．桉叶油和氮酮对替硝唑凝胶剂体外透皮释药的研究［J］．海峡药学，2003，15(1):18-19．

［12］李建华，周敏君，裘学丽．桉叶油霜对蠕形螨的疗效观察［J］．中国人兽共患病杂志，2001，17(3):98-99．

［13］严敖金，谭青安．桉叶精油对三种天牛的忌避效果［J］．南京林业大学学报，1998，22(1):87-90．

［14］赵亚娥，郭娜，李琛，等．桉叶油对两种蠕形螨的体外杀虫作用［J］．中国媒介生物学及控制杂志，2006，17(6):461-464．

［15］李建华，周敏君，郎书源，等．桉叶挥发油对几种寄生虫驱杀作用的研究［J］．贵阳医学院学报，2000，25(4):362-364．

［16］余永莉，王传铜，冯国纹，等．桉叶油毒性及其对环磷酰胺致小鼠骨髓微核及精子畸形的保护作用［J］．中国药理与毒理学，2010，24(6):529-532．

［17］余永莉，冯国纹．唐于川，等．桉叶油对环磷酰胺致大鼠胚胎毒性的保护作用［J］．中国现代应用药学，2011，28(3):189-193．