AGT、ApoB、ApoE、MTHFR、eNOS 基因多态性与昆明地区冠心病的关系

马 娟，陈吉丽

(昆明市第一人民医院，昆明650000)

冠心病(CHD)是由环境因素和遗传因素共同作用导致的复杂疾病［1］。近年来，国内外陆续开展了对心脑血管疾病致病基因的研究，但多局限于单个基因的多态性，而且研究结果因不同种族、不同地区人群及不同研究方法而存在差异。目前对冠心病多基因交互作用的研究报道并不多见。本研究利用基因芯片技术，选择与冠心病密切相关的血管紧张素原(AGT)、载脂蛋白 B(ApoB)、载脂蛋白 E(ApoE)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)等5个基因多态性位点，研究它们与冠心病的相关性及基因—基因的交互作用。

1 资料与方法

1．1 临床资料 选择2007年1月～2009年12月我院收治的CHD患者89例(CHD组)，均经冠状动脉造影确诊，至少一支主要血管狭窄≥50%。其中男62例、女27 例，年龄(60．01 ±12．40)岁。同期选择冠状动脉造影未发现病变者78例作为对照组，男44例、女 34例，年龄(64．27±11．28)岁。两组父系、母系3代均居住在云南昆明境内，且个体均无血缘关系。

1．2 方法

1．2．1 临床资料收集 患者入院后采集清晨空腹肘静脉血，离心处理后，采用双试剂酶法检测TC、TG、HDL-C、LDL-C。用Hp5500超声心动仪对左室舒张末径(LVDd)、左室收缩末径(LVSd)进行二维测量，计算左室射血分数(EF)，EF=(左室舒张末径－左室收缩末径)/左室舒张末径。

1．2．2 基因多态性检测 ①基因组DNA提取:采集患者静脉血0．5 mL，加入2%EDTA溶液，2～8℃保存，采用酚—氯仿法提取基因组DNA。②相关基因多态性检测:用上海百傲生物技术有限公司提供的基因芯片检测 AGT M235T(MM、MT、TT)、ApoB XbaI(X－X－、X+X－、X+X+)、ApoE 112/158(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)、MTHFR C667T(CC、CT、TT)及 eNOSD298E(EE、DE、DD)等5 个位点基因多态性，按说明书进行操作。主要仪器:离心机:centrifuge TGL-16G，上海安亭产品。核酸蛋白检测仪:Biophotmeter，eppendorf产品。PCR扩增仪:My-CyclerTM Thermal Cycler，BIO-RAD公司产品。凝胶成像分析仪:Gel Doc 2000TM，BIO-RAD公司产品。生物芯片识读器:Biochip Reader，上海百傲生物技术有限公司产品。基因分析软件:Array Doctor2．0，由上海百傲生物技术有限公司提供。每次检测均设置阴性、阳性、对照品，当软件判断标志列、阴性、阳性对照均合格时，会自动输出检测结果。见表1。

表1 AGT、ApoB、ApoE、MTHFR 及 eNOS测试结果

1．2．3 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件，计量资料以±s表示，比较采用成组t检验。基因多态性分布频率的比较采用χ2检验。多基因交互作用采用MDR1．10版，用交叉验证有效一致性系数最大、检验样本的准确度最高的原则，寻找等位点基因交互作用的模型。显著性检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 两组临床资料比较 见表2。

表2 两组临床资料比较±s)

表2 两组临床资料比较±s)

注:两组各指标比较，P均＞0．05

组别 n TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL(mmol/L) LVDd(mm) LVSd(mm) EF(%)CHD 组 89 4．81 ±1．27 2．01 ±1．28 1．11 ±0．31 51．73 ±8．40 36．19 ±10．37 56．85 ±14．31对照组 78 4．88 ±1．37 1．91 ±1．13 1．17 ±0．34 50．94 ±9．76 34．46 ±11．26 60．28 ±14．10

2．2 基因型多态性频率的Hardy-Weinberg平衡检验 AGT M235T(MM、MT、TT)、ApoB XbaI(XX－、X+X－、X+X+)、ApoE 112/158(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)、MTHFR C667T(CC、CT、TT)及 eNOS D298E(EE、DE、DD)等位点基因型多态性频率的符合Hardy-Weinberg平衡检验，说明样本有代表性。

2．3 两组 AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E基因型及等位基因分布频率比较 见表3。

2．4 CHD 患者 AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E等位点基因—基因的交互作用 用MDR分析软件对5个位点基因—基因交互作用进行分析，共出现了3个模型，四位点AGTM235T-ApoE112/158-ApoBXbaI-eNOSD298E模型的交叉验证一致性系数最大(10/10)，为最佳模型，但两组比较差异无统计学意义(P＞0．05);三 位 点 AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI差异有边缘统计学意义(P=0．05)，两位点AGT M235T-ApoE 112/158无统计学意义(P＞0．05)。见表4。

表3 两组AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T及eNOS D298E基因型及等位基因分布频率比较［例(%)］

表4 5个位点基因—基因交互作用模型及其性能评价

3 讨论

3．1 基因多态性与CHD的相关性 近年研究表明，AGT基因 TT 型是冠心病的独立危险因素［2，3］，AGT基因TT型和ACE基因DD型联合进一步增加心肌梗死的危险性［4］;但也有结论提示它们之间无相关性［5，6］。本研究结果显示，CHD 组 AGT M235T基因型分布、T等位基因频率与对照组相比有统计学差异，AGT基因TT型显著高于对照组，提示AGT基因TT型与冠心病的发生呈正相关;AGT T等位基因频率为 0．747 2，与文献［2，7，8］报道不尽相同，提示存在种族和地域的差异。

目前国内外大部分研究显示ε4等位基因有致动脉粥样硬化的作用，与CHD的发病密切相关。Grane 等［9］发现，携 带 ε4基 因 (包 括 ApoEε4/4、ApoEε3/4基因型)的患者有更高的颈动脉内膜厚度，并且冠脉病变的范围和严重程度均大于携有ε3基因(ApoEε3/3)的患者。本研究结果显示，CHD组ApoEε3/4基因型及ε4等位基因频率明显高于对照组，提示ApoE 112/158基因多态性及ε4等位基因与CHD发生呈正相关。但也有少数研究发现ApoE基因型与CHD并无任何联系［10］。

Peacock等［11］报道，具有X+等位基因者其LDL水平显著增高。另有研究表明，具有X+X+基因型者的健康人群较X－X－基因型者的ApoB水平明显增高。X+等位基因频率在CHD组明显高于正常对照组，推测ApoB基因本身的功能性突变发生连锁不平衡，直接导致动脉粥样硬化的形成，或者通过影响胆固醇酯在HDL和LDL中的转换速率，导致HDL水平降低，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。本研究结果显示，ApoB X+X+基因型及X+等位基因与CHD的发生发展呈正相关，与以上结论一致。

目前MTHFR基因C677T多态性与CHD的关系尚存在很大分歧，Rothenbacher等［12］认为MTHFR基因多态性与血浆Hcy水平和CHD无关。Kang等［13，14］报道了MTHFR 突变，并提出MTHFR 是冠心病的一个危险因素。张雄信等［15］通过文献检索收集MTHFR基因C677T多态性与CHD关系的全文文献，对各研究OR值进行Meta分析，结果表明中国汉族人MTHFR基因C677T多态性与CHD有关联，T等位基因携带者易发生CHD。本研究结果显示，纯合突变MTHFR TT基因与CHD的发病具有相关性，而易感的T等位基因频率与CHD的发生无明显相关性。

Hingorani等［16］发现，英国东盎格鲁地区的冠心病和对照患者eNOS D298E纯合体的比例分别为35．9%和 10．2%;Ichihara 等［17］报道，急性心肌梗死患者中eNOSD298E纯合体的比例为2．2%，而对照组却未发现该型;本研究中CHD组eNOSD298E纯合体比例为80．90%，对照组为79．49%，明显高于以上报道，但无统计学差异。

3．2 多个基因交互作用与CHD的相关性 研究发现，CHD的发生与多个遗传位点的多态性的联合作用有关，即存在基因—基因之间的交互作用。本研究用MDR统计学方法对CHD患者AGT M235T、ApoB XbaI、ApoE 112/158、MTHFR C667T 及 eNOS D298E 5个位点基因型多态性进行了交互作用的研究，结果显示，四位点 AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI-eNOSD298E模型的交叉验证一致性系数最大，为最佳模型，但两组比较差异无统计学意义。两位点AGT M235T-ApoE 112/158无统计学意义;三位点AGT M235T-ApoE 112/158-ApoB XbaI差异有边缘统计学意义。提示 AGT M235T、ApoE 112/158及ApoB XbaI等3个位点基因多态性之间可能存在基因—基因交互作用。分析其原因在于并不是所有CHD患者均携带易感基因，在同一个人群中各个易感基因分布频率不一致，同一个患者同时携带多个易感基因概率则更低，鉴于本研究样本数较少，因此未能完全证实基因位点之间可能存在基因—基因交互作用。本课题是对诸如冠心病等多基因疾病的基因—基因交互作用模型构建及效应预测的有益尝试。

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