去甲斑蝥素对肝癌细胞AIF蛋白的影响

李先茜，余 琛，吴嘉熙，李水军，李晓丽

(上海市徐汇区中心医院中心实验室，上海200031)

斑蝥素是从中药斑蝥中提取的抗肿瘤活性成分，70年代曾试用于治疗原发性肝癌，能够缓解患者病情，但其剧毒以及对泌尿系统的严重刺激限制了其临床应用。去甲斑蝥素(NCTD)是斑蝥素的衍生物，由呋喃与马来酐氢化制成，其构型与斑蝥素相似，但1、2位去除了斑蝥素的两个甲基，因此对泌尿系统的刺激基本消失。NCTD主要用于治疗肝癌、食管癌及胃癌等，具有较强的抗肿瘤活性和独特的升高白细胞作用。2011年7月～2012年12月，本研究观察了NCTD对肝癌组织中分子标志物细胞凋亡诱导因子(AIF)蛋白的影响，旨在为NCTD治疗肝癌的疗效及用量提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料 人肝癌SMMC-7721细胞株购自上海细胞所国家细胞库，NCTD购自山东莒南制药厂，小牛血清、MTT和二甲基亚砜购自上海普飞生物技术有限公司，RPMI 1640干粉培养基和胰蛋白酶购自GBICO公司，抗体AIF购自SANTA公司。主要仪器:荧光倒置显微镜(日本)，CO2培养箱(英国)，紫外分光光度计(美国HACH公司DR/4000UV-VIS)，电泳装置(BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ)，转移装置(BIO-RAD公司Mini-PROTEANⅡ)，恒流恒压电泳仪(BIO-RAD公司 Mini-PROTEANⅡ)，摇床(上海申能博彩生物公司)，胶片分析仪(上海天能公司)。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养与接种 将肝癌细胞加入含10%小牛血清的RPMI 1640高糖培养基，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养;细胞贴壁后用0．25%胰酶消化，分瓶再培养，待进入对数生长期约为传代后24 h时，弃原培养液，PBS冲洗，0．25%胰酶消化，用培养液重悬，调整细胞密度至4．25×105/mL，接种到6孔板中，使每孔细胞数为8．5×105个，共4孔，分别为药物 NCTD 浓度0、10、50、100 g/mL组。5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中预培养24 h。

1．2．2 药物作用细胞后总蛋白的提取及浓度测定待细胞贴于细胞培养板底后，将6孔板中原细胞培养上清液倒掉，分别加入细胞培养液配制的浓度为0、10、50、100 g/mL NCTD，置5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中预培养24 h。将药物作用后的细胞经PBS冲洗，0．25%胰酶消化，离心，弃上清，收集细胞，加入细胞裂解液。冰上放置10 min，重悬5 s，离心，收集上清液至新管中，加入工作液并震荡混匀，用紫外分光光度计测A595值。

1．2．3 Western blot实验 取对数生长期肝癌细胞加入不同浓度培养液配制的NCTD，调整至终浓度为0、10、50、100 g/mL，继续培养24 h。PBS 洗2 次，加入细胞裂解液100μL，离心20 min，取上清液，肝癌细胞总蛋白定量后分别取50 g总蛋白加入上样缓冲液，95℃变性10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭后依次加入一抗和二抗，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤。加入化学发光试剂，放入暗盒中显影，照相，应用凝胶成像仪软件进行半定量分析。

1．2．4 统计学方法 应用PEMS3．1统计软件进行数据分析，结果以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组总蛋白浓度检测结果 与标准曲线同时测出的样品数值及总蛋白浓度见表1。

2．2 NCTD诱导肝癌细胞凋亡过程中AIF蛋白的表达 Western blot实验结果见图1。0、10、50、100 g/mL NCTD作用于肝癌细胞后，从线粒体释放入胞质的AIF蛋白被活化，AIF的表达量分别为(0．28±1．5)%、(0．37 ±1．6)%、(0．46 ±2．2)%，与对照组的(0．14±1．2)%相比，均有统计学差异(P ＜0．05或＜0．01)，且其活化程度呈浓度依赖性。

表1 总蛋白浓度与样品数值检测结果

图1 NCTD对肝癌细胞AIF表达的影响

3 讨论

我国每年至少有11万人死于原发性肝癌，占世界肝癌年死亡人数的45%。虽然近年来肝癌的早期检出率有所提高，但由于肝癌易发生早期肝内转移，且85%以上合并严重肝硬化，致使大部分患者确诊时已失去手术机会［1］。对于不能手术切除的肝癌患者，中药治疗是重要的治疗方法之一。人类应用中药斑蝥治病已有两千多年的历史，北宋《仁斋直指方》中已有斑蝥治疗癌症的明确记载。斑蝥为芫青科昆虫南方一大斑蝥或黄黑小斑蝥的干燥体，其味辛、热，有大毒，归肝、胃、肾、大肠和小肠经，具有攻毒蚀疮、逐淤散结的功效。斑蝥抗癌的主要成分为斑蝥素，NCTD是斑蝥素去甲基化衍生物，抗癌作用进一步增强，泌尿系等毒性明显减轻。NCTD是我国最早人工合成的抗肿瘤药物，主要用于治疗消化系统肿瘤如肝癌、食管癌、胃癌等，并具有升高白细胞、保护肝功能和免疫调节等作用。随着NCTD基础和临床研究的深入，其抗癌和升高白细胞的机制将进一步被阐明，在肿瘤的治疗中发挥更重要的作用。

肿瘤的发生、发展与细胞增殖和凋亡失衡有关，NCTD既可抑制肿瘤细胞的增殖，也可能诱导肿瘤细胞的凋亡［2，3］。AIF是核基因编码的、相对分子量为57 kD的黄素蛋白，位于线粒体双层膜间区。AIF是一种十分保守的蛋白，在人和小鼠中，AIF cDNA的活性具有高达92%的同源性。其C段第128～612位氨基酸残基与植物抗坏血酸酶和细菌的还原型辅酶Ⅰ也有很高的同源性，在凋亡诱导因素的刺激下，AIF可从线粒体转位进入胞核，独立地将DNA裂解为60 kB左右的DNA片段，直接引起染色质浓缩及DNA的断裂［4～6］。Bcl家族能通过PT孔的开放调控AIF的释放，但不能影响其活性，AIF的凋亡效应不依赖 caspase、自身氧化和还原酶的活性［7～9］。另有研究表明，AIF抗体可以抑制 Cyto C的释放和caspase的级链反应，但Cyto C和caspase的抑制剂并不能影响AIF的释放，可见AIF在Cyto C/caspase凋亡途径的上游发挥促凋亡作用。

研究显示，AIF基因敲除或注射抗AIF抗体的细胞对多种刺激引起的细胞凋亡有抗性;AIF缺陷小鼠胚胎，缺乏胚胎腔形成过程中应有的细胞凋亡;AIF缺陷胚胎干细胞对维生素K3和血清饥饿诱导凋亡产生抗性［10］。作为氧化还原酶，AIF对维持线粒体正常的生理功能有重要意义。目前还不能确定这些表型改变是由于灭活AIF诱导凋亡活性造成，还是AIF的氧化还原酶作用丢失的结果。AIF诱导细胞凋亡的生化机制尚不十分清楚，AIF可能与其他蛋白共同调节完成这一作用。

我们以往的研究表明，NCTD对人肝癌细胞SMMC-7721生长具有很强的抑制作用。本实验结果表明，NCTD作用于人肝癌细胞SMMC-7721后，从线粒体释放入胞质的AIF蛋白被活化，且其活化程度呈浓度依赖性。AIF蛋白可能作为肝癌治疗过程中疗效的分子标志物之一，这为肝癌治疗过程中的疗效观察及药物用量提供有利的实验依据。

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