肿瘤坏死因子基因多态性与非小细胞肺癌易感性的相关性研究

郭宇玲，陈 丽，刘 佳，孙 哲

（南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌 330006）

原发性肺癌（简称肺癌）是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一。 肺癌的发生是一个多因素、多步骤的过程，除环境因素外，个体的遗传易感性因素也是导致肺癌发生的重要原因。流行病学研究［1-2］表明，肺癌具有家族聚集现象，目前家族的遗传易感性所起的作用逐渐为人们所重视。 肿瘤坏死因子-α（TNF-α）位于6 号染色体短臂Ⅲ类MHC 区域，其启动子区域存在多种等位基因多态现象，TNF-α 基因多态现象与血清TNF-α 表达水平密切相关，并与某些肿瘤的易感性有关。 有资料显示，TNF-α 基因多态性可能与肺癌的易感性有关，非小细胞肺癌约占肺癌点数的80%［3-4］。本研究旨在探讨肿瘤坏死因子基因多态性与非小细胞肺癌易感性的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2007 年1 月至2012 年1 月南昌大学第一附属医院肿瘤科收治的非小细胞肺癌患者60 例（肺癌组），均符合病理学诊断。 其中男38例，女22例，年龄38～82 岁，平均51 岁；鳞癌38 例，腺癌22例。 临床分期：Ⅰ+Ⅱ期14 例，Ⅲ+Ⅳ期46 例。 均签署知情同意书。 另选择同期门诊体检的健康人62例（对照组），男45 例，女17 例，年龄35～70 岁，平均47 岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂

基因组DNA 提取试剂盒（北京天为时代公司）、2×Taq PCR MasterMix（北京天为时代公司）、DNA marker（Takara,Japan）、人TNF-α 引物（上海生工公司）、NcoⅠ（Fermentas）、MspⅠ（Fermentas）等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

采集肺癌组患者及对照组体检健康者空腹、外周静脉血2 mL。

1.3.2 基因多态性分析

采用PCR-RFLP 分析基因型，按照试剂盒操作方法提取全基因组DNA。 PCR 反应体系总体积为50 μL，内含模板DNA 2 μL ,引物各1 μL，4×dNTP 4 μL，10×butter (不含Mgcl2)5 μL，Mgcl23 μL， Taq酶(3 U·μL-1) 1 μL, 双蒸水25 μL。 将反应液置于PCR 扩增仪中，反应条件： 预变性95 ℃5 min，变性95 ℃45 s，退火59 ℃45 s，延伸72 ℃45 s 共40个循环，最后在72 ℃下延伸10 min。 扩增完毕后，取10 mL PCR 反应产物用10 U 限制性内切酶StyI消化，反应体系为总体积20 μL，扩增后DNA 10 μL，10×buffer 2.5 μL，BSA 0.3 μL，StyI 酶0.5 μL，双蒸水6 μL，并在37 ℃水浴中4 h 以上。 用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离反应产物，电泳分离完毕，置于300 nm 紫外灯下检测，观察电泳条带，以特定的DNA marker 为参照，确定基因型（封四图1-2）。TNF-α-308 G/G：-87 bp 条带；TNF-α-308 A/A：-107 bp 条带；TNF-α-308 G/A：87 bp、107 bp 2条带；TNF-α-238 G/G：-152 bp 条带；TNF-α-238 A/A：-132 bp 条带；TNF-α-238 G/A：-152 bp、-132 bp 2 条带。

1.4 统计学方法

基因型和等位基因频率采用直接计数法，各组基因型和等位基因频率差异比较采用χ2检验或确切概率法检验来判断TNF-α 基因-308 G＞/A、-238 G＞/A 多态现象与非小细胞肺癌的相关性。

2 结果

2.1 TNF-α 基因启动子-308 位点多态性现象与非小细胞肺癌的关系

肺癌组与对照组均未检测出TNF-α-308 A/A纯合子基因型，G/G 基因型频率在2组的分布中差异有统计学意义（P＜0.01）。 鳞癌组与腺癌组、Ⅰ+Ⅱ期组与对照组的G/G 基因型与G/A 基因型在分布频率上比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。 Ⅲ+Ⅳ期组与对照组的基因型分布频率上比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 但G/G 基因型与G/A 基因型在不同分期肺癌组中的分布的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表1。

表1 TNF-α-308 位点多态性与非小细胞肺癌及病理类型、临床分期的关系

2.2 TNF-α 基因启动子-238 位点多态性现象与非小细胞肺癌的关系

肺癌组与对照组均未检测出TNF-α-238 A/A纯合子基因型，G/G 基因型频率在2组的分布上差异有统计学差异（P＜0.05）。鳞癌组、腺癌组与对照组相比，G/G 基因型与G/A 基因型频率分布的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），但G/G 基因型与G/A基因型在鳞癌组与腺癌组的分布频率、腺癌组与对照组中的分布频率差异无统计学意义（均P＞0.05）。Ⅰ+Ⅱ期组与对照组的基因型分布频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。Ⅲ+Ⅳ期组与对照组的基因型分布频率上比较差异有统计学意义（P＜0.05），但G/G 基因型与G/A 基因型在不同分期肺癌组中的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表2 TNF-α-238 位点多态性与非小细胞肺癌及其病理类型、临床分期的关系

3 讨论

TNF-α 在恶性肿瘤的发生发展过程中起重要作用，TNF-α 的表达主要受转录水平的调节，TNF-α基因启动子的多态现象和TNF-α 的产物水平相关［5］。 TNF-α 基因在启动区域内-308 位点存在着2个基因多态：TNF-α1 基因型和TNF-α2 基因型。 分析-308 位点多态性对基因转录的影响，发现TNF-α2基因型的患者体内TNF-α 水平明显高于TNF-α1基因型［6-7］。 同样，TNF-α 基因在启动区域内-238A位点也存在着基因多态现象，存在G→A 变化。有研究认为，银屑病患者中-238 A 与TNF-α 的低表达密切相关；TNF-α 启动区域内-308、-238 位点的多态现象与肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤的易感性有关［8-10］。

本实验研究结果显示：肺癌组及对照组均未检测出TNF-α-308 A/A、TNF-α-238 A/A 纯合子，可能与其基因型在人群中分布频率低及样本量较小有关。 肺癌组基因型分布频率高于对照组，因此推测TNF-α-308 位点的基因多态现象与非小细胞肺癌存在一定的关联。 在Ⅰ＋Ⅱ期组与对照组的比较中，TNF-α-308 G/A 基因型分布频率无明显差异，而Ⅲ＋Ⅳ期组其分布频率明显高于对照组，提示TNF-α-308 A 等位基因对肺癌的发生发展可能有促进作用。肺癌组TNF-α-238 G/A 基因型低于对照组，说明其等位基因多态现象与非小细胞肺癌的发生也存在关联。 Ⅰ＋Ⅱ期组与对照组比较，基因型频率分布无明显差异，Ⅲ＋Ⅳ期组与对照组比较，基因型频率分布差异有统计学意义，提示TNF-α-238 等位基因可能与疾病进展有关，但也可能与样本含量较小不能进行多元回归分析或基因分布频率低有关。 且所研究的对象均为江西人，因此不能排除人种区别。 本研究没有分析基因多态性对各种治疗的影响，有待于今后密切随访患者，扩大样本含量进行研究。

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