正交试验优选杜仲炮制工艺

罗跃龙，严瑞娟，，张水寒，蔡 萍，肖 娟，万 丹

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南省中医药研究院中药新药研究与开发重点实验室，湖南 长沙410013）

杜仲为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥树皮，有补肝肾、强筋骨、安胎之功效，用于治疗肝肾不足、腰膝酸痛、胎动不安等症[1]。明·陈嘉谟《本草蒙筌》提出“入盐走肾脏仍仗软坚”，故临床上杜仲多以盐炙品入药，以增强其补肾健腰、强筋骨之功。传统的炮制方法为盐炙，标准以断丝为宜，程度难以掌控，往往“太过”或“不及”，且劳动强度大，后提出烘法炮制杜仲[2]。但以上两种方法的具体的操作工艺参数均说法不一，造成杜仲炮制品质量难以保证，而饮片质量是发挥临床疗效的关键因素，作者未见有杜仲炮制工艺研究将切制规格横丝、纵丝、块结合温度、时间进行考察的记载，因此本文采用正交试验法，首次以切制规格（横丝、纵丝、块）、温度、时间为考察因素，探索盐炙和烘制的最佳工艺，以期为提高和规范杜仲饮片的质量提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验仪器

LC-10ATVP高效液相色谱仪（日本岛津，配备SPD-M10AVP光电二极管阵列检测器，CLASS-VP色谱工作站）；AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精密实验设备有限公司）；美的SK2103电磁炉；格兰仕G8023YSL-V1型微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）；KQ3200型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

松脂醇二葡萄糖苷对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-12021001，纯度＞98%）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.3 试药

杜仲皮于2012年6月采自贵州省遵义市枫香镇，经湖南省中医药研究院中药研究所谢昭明研究员鉴定为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的树皮，发汗备用。

2 方法与结果

2.1 杜仲炮制工艺的设计

2.1.1 盐炙杜仲 通过预实验及参考文献[3-4]，选择切制规格（A）、盐炙温度（B）、盐炙时间（C）作为炮制工艺的考察和外观质量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作为评价指标，以综合评分的方法，采用L9（34）表进行正交试验。具体炮制方法：取杜仲皮，刮去残留粗皮，洗净，分别切制成0.5 cm横丝、0.5 cm纵丝和2 cm×2 cm的块，干燥。称取9份，每份100 g，加食盐水（每100 kg药材用10 L 20%食盐水）浸润，待盐水被吸尽后，置于铁锅中于电磁炉上进行盐炙，按表1因素水平安排制备炮制样品，平行试验3次。

2.1.2 烘制杜仲 通过预实验及参考相关文献[3-4]，选择切制规格（A）、烘制温度（B）、烘制时间（C）作为炮制工艺的考察和外观质量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作为评价指标，以综合评分的方法，采用L9（34）表进行正交试验。具体炮制方法：同“2.1.1”方法净制、切制、加盐水浸润后，取9份，每份100 g，分别平铺于瓷托盘上，放入电热鼓风干燥箱内，按表2因素水平安排制备炮制样品，平行试验3次。

表1 盐炙杜仲因素水平表

表2 烘制杜仲因素水平表

2.1.3 数据处理 为客观地反映杜仲炮制工艺中各个因素对成品质量的影响，本试验以传统外观质量、醇溶性浸出物量及与杜仲功能主治相关的功效成分松脂醇二葡萄糖苷含量作为评价指标。传统外观质量评分，色泽方面：样品表面黑褐色为5分；表面焦黑为4分；表面浅棕色为3分，再随颜色变浅依次逐减。断丝程度：将样品沿胶丝生长方向拉长0.1 cm断丝者为5分；拉长0.2 cm断丝者为4分；拉长0.3 cm断丝者为3分；依次逐减。以综合质量评分法进行评价，因有效成分松脂醇二葡萄糖苷含量占据重要地位，故其加权系数为0.7，醇溶性浸出物量加权系数为0.2，传统外观质量加权系数为0.1。综合质量评分＝70×(松脂醇二葡萄糖苷实际量/松脂醇二葡萄糖苷最高量)＋20×(醇溶性浸出物实际量/醇溶性浸出物最高量)＋10×(传统外观质量实际评分/传统外观质量最高分)。

2.2 醇溶性浸出物的测定[1]

取炮制杜仲样品适量，剪成碎片，揉成絮状，取2 g，精密称定，置250 mL锥形瓶中，精密加75%乙醇100 mL作溶剂，按《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅩA醇溶性浸出物测定法（热浸法）测定，以干燥品计算样品中醇溶性浸出物量。

2.3 松脂醇二葡萄糖苷含量的测定[1]

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Promosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水(25∶75)，检测波长277 nm，体积流量1.0 mL/min，柱温25℃，进样量20μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取松脂醇二葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.49 mg/mL的溶液，摇匀即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取炮制杜仲样品适量，剪成碎片，揉成絮状，取约5 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声处理60 min[5]，放冷。再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色谱仪，测定。对照品进样量（Y）对其相应色谱峰峰面积（X）的线性回归方程为：

表明松脂醇二葡萄糖苷在0.98～9.8μg范围内峰面积与进样量的线性关系良好。

2.3.4 样品测定 分别精密吸取各炮制杜仲样品的供试品溶液20μL、对照品溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪中，按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定，外标一点法计算样品（以干燥品计）中松脂醇二葡萄糖苷的含量。

2.4 试验结果及方差分析

2.4.1 试验结果 盐炙和烘制杜仲工艺的正交试验结果见表3～4。

表3 盐炙杜仲工艺正交试验结果 （±s，n=3）

表3 盐炙杜仲工艺正交试验结果 （±s，n=3）

列号 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外观质量(分) 综合评分1 1 1 1 1 0.59±0.0 1 14.84±0.41 6 33.79 2 1 2 2 2 0.59±0.0 1 14.81±0.34 9 36.75 3 1 3 3 3 0.88±0.0 1 16.44±0.38 8 42.81 4 2 1 2 3 1.11±0.02 16.35±0.35 5 43.79 5 2 2 3 1 1.94±0.0 4 17.15±0.37 6 60.47 6 2 3 1 2 1.85±0.0 3 15.98±0.42 9 60.50 7 3 1 3 2 2.71±0.0 4 16.85±0.52 7 74.80 8 3 2 1 3 2.43±0.0 4 16.33±0.42 9 71.22 9 3 3 2 1 1.76±0.0 4 15.90±0.52 8 57.81 K 1 113.35 152.37 165.51 152.07 K 2 164.76 168.44 138.35 172.05 K 3 203.82 161.12 178.07 157.81 R 90.47 16.07 39.72 19.98

表4 烘制杜仲工艺正交试验结果 （±s，n=3）

表4 烘制杜仲工艺正交试验结果 （±s，n=3）

列号 A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外观质量分(分) 综合评分1 1 1 1 1 1.19±0.0 2 15.21±0.38 9 47.88 2 1 2 2 2 0.75±0.0 1 14.22±0.30 9 38.91 3 1 3 3 3 0.52±0.0 1 12.72±0.35 9 33.07 4 2 1 2 3 1.79±0.0 3 16.67±0.46 10 61.24 5 2 2 3 1 1.51±0.0 3 15.53±0.42 7 51.94 6 2 3 1 2 1.21±0.0 2 11.18±0.26 9 43.54 7 3 1 3 2 3.94±0.0 8 16.33±0.47 9 98.04 8 3 2 1 3 0.44±0.0 1 12.17±0.25 8 30.01 9 3 3 2 1 0.07±0.0 1 12.76±0.32 8 24.12 K 1 119.86 207.17 121.42 123.94 K 2 156.72 120.86 124.27 180.49 K 3 152.18 100.73 183.05 124.32 R 36.86 106.44 61.63 56.55

2.4.2 方差分析 盐炙杜仲及烘制杜仲的方差分析结果分别见表5～6。

表5 盐炙杜仲工艺方差分析表

表6 烘制杜仲工艺方差分析表

盐炙杜仲工艺以综合质量为评价指标时，由极差R可知影响盐炙杜仲质量的主次因素依次为A＞C＞B，方差分析结果显示，A因素有显著性影响，而B和C因素无明显影响；最佳盐炙工艺方案为A3B2C3，即切制成2 cm×2 cm的块，盐炙温度为180℃，盐炙时间为10 min。

烘制杜仲工艺以综合质量为评价指标时，由极差R可知影响烘制杜仲质量的主次因素依次为B＞C＞A，方差分析结果显示，方差分析结果显示，A、B和C因素均无明显影响；最佳烘制工艺方案为A2B1C3，即切制成0.5 cm的纵丝，烘制温度为120℃，烘制时间为0.5 h。

2.5 验证试验

本实验优选出的盐炙与烘制工艺最佳组合均不在正交表试验方案中，故需进行验证试验。盐炙：将杜仲切制成2 cm×2 cm的块，称取100 g置于铁锅中，于电磁炉上180℃盐炙10 min，取出，晾凉即得。平行试验3次。烘制：将杜仲切制成0.5 cm的纵丝，称取100 g平铺于瓷托盘上，放入120℃的电热鼓风干燥箱内，烘制0.5 h。平行试验3次。验证结果见表7。并用SPSS 16.0软件对两种工艺结果进行t检验。

表7 验证试验结果 （±s）

表7 验证试验结果 （±s）

试验组 松脂醇二葡萄糖苷(mg/g) 醇浸出量(%)盐炙 2.78±0.04 17.13±0.05烘制 4.01±0.04 16.48±0.05

验证试验表明，二指标数据均大于正交表9个组合中任何一组，故优选的工艺参数合理可行，能制备出质量稳定的杜仲饮片。用SPSS 16.0软件输出的t检验结果中，t统计量的相伴概率P均为0，小于显著性水平0.05，证明两种工艺的松脂醇二葡萄糖苷含量和醇浸出量平均值存在显著性差异。考虑到松脂醇二葡萄糖苷为杜仲的主要有效成分，故认为烘制工艺为较佳选择。

3 讨论

前人对杜仲炮制品质量评价方面，有的采用断丝率或单采用醇浸出物为指标，评价指标单一。松脂醇二葡萄苷为杜仲的主要的降压成分[6]，以其为主要评价指标，再结合《中华人民共和国药典》2010版一部中规定的醇浸出物量，更能合理地反映出炮制品的质量。另外，在炮制工艺的考察因素上，前人还常涉及加盐量的考察，但通过预实验及文献研究，加盐量对炮制质量影响不大，反而是不同的切制规格成为炮制质量优劣的关键因素，故本文将切制规格列为考察对象之一。

本研究同时优选了盐炙和烘制两种方法的操作工艺，其中烘制工艺中于120℃烘制0.5 h时纵丝和块的综合评分均较高，盐炙最佳工艺的切制规格亦为块，这与历来研究得出的杜仲以切制成横丝为最佳的结论有所不同，可见切制规格或许也因“法”制宜。通过比较两种炮制方法的最佳工艺，烘制品较盐炙品综合质量高，且烘法有节能、回收率高、劳动强度低等优点，便于规模化。后续研究将进一步从药理学试验、临床研究等方面论证烘制杜仲的工艺效果，企业可考虑以此法替代传统盐炙法而达到低成本规范化生产，并提高杜仲饮片的质量从而提高效益。

[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：154.

[2]郝武常，朱志峰，朱宇红，等.炮制对杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量的影响[J].中国中药杂志，1996，21(7)：410.

[3]李 川.不同炮制方法对杜仲总成分煎出率的影响[J].中药材，1989，12(2)：29.

[4]高学昌，赵海东.杜仲炮制初探[J].时珍国医国药，1994，5(3)：25.

[5]冯锁民，甘志杰，翟西峰，等.杜仲原生皮与再生皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量比较[J].中药材，2006，28(8)：792-794.

[6]韩宇东，李文娜.杜仲的化学成分和药理活性及临床应用研究新进展[J].中国实用医学杂志，2010，20(5)：3-5.