益肺通络颗粒的主要药效学研究

2013-06-09左亚杰曾建国刘艳科

湖南中医药大学学报 2013年5期

欧艳，杨励，左亚杰，曾建国，刘艳科

（1.长沙市中心医院，湖南长沙410004；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410002）

结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，目前全球有约20亿人被感染，每年新出现结核病患者约800～1 000万[1]，每年因结核病死亡人数约为200～300万。据世界卫生组织(WHO)报道，全球结核病总耐药率为20.0%，耐多药率为5.3%，估计全球耐多药结核病已达50万例[2-3]。我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，居世界第2位，其中肺结核患者耐多药率为6.8%。

益肺通络颗粒是我院中医专家刘艳科教授的经验方，国家“十一五”科技重大专项研究—中医药治疗肺结核临床科研基地建设的基础研究中的自拟处方(“益肺通络方”已申请处方专利，发文序号2011041400413580)，由黄精、白及、太子参、百部、矮地茶、紫花地丁、大蓟等11味药组成，具有益气养阴、化瘀通络、去腐生新的功效，主治气阴两虚夹瘀型耐多药肺结核。本文参考《中药新药研究指南》[4]的要求及相关实验方法[5]，对益肺通络颗粒进行了抗结核、抑制超敏、增强免疫及止咳等方面的研究，旨在为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物小白鼠，昆明种，SPF级，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号：HNASLKJ20102986。

1.1.2 药物益肺通络颗粒（湖南中医药大学附属第一医院制剂室提供，批号：20110625，生药含量：3.13 g生药/g，成人日用量：75.12 g生药/d）；异烟肼片（0.1 g/片，山西云鹏制药有限公司，批号：100402）；盐酸左旋咪唑片（25 mg/片，南京白敬宇制药厂，批号：100101）；枸橼酸喷托维林片（25 mg/片，河南省安阳市第一制药厂，批号：100502）。强毒人型结核菌（H37RV）菌株，中国疾病预防控制中心；2，4-二硝基氯苯（安徽八一化工股份有限公司，医药级，批号：093356）；印度墨汁（北京笃信精细制剂厂，批号：0040823）；浓氨水（南宁第二化工厂，批号：091023）。

1.1.3 仪器 721分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.1.4 药物配制方法和实验动物分组各药物均临用前用蒸馏水配制成所需浓度的混悬药液。益肺通络组低、中、高剂量分别为含生药6、12、24 g/kg。实验动物随机分为6组：第1组为正常对照组，第2组为模型对照组，灌胃给等体积蒸馏水；第3、4、5组分别为益肺通络低、中、高剂量组；第6组为阳性药物组；或5组：空白对照组，灌胃给等体积蒸馏水；益肺通络低、中、高剂量组；阳性药物组。每组动物12只，给药体积：20 mL/kg，均灌胃给药。

1.2 方法

1.2.1 对结核杆菌感染动物的治疗作用参考文献方法[6]，取健康昆明种小鼠72只，雌雄各半，体质量（17.1±0.6）g。适应环境后，按性别、体质量分层，随机分为6组，每组12只。除空白对照组小鼠外，其他各组小鼠尾静脉注射接种2 mg/mL人型结核杆菌（H37RV）0.2 mL/只。感染后第3日，各组灌胃给药，异烟肼组给予0.75 g/kg异烟肼片，连续3 d。连续3周观察各组小鼠死亡情况，计算各组小鼠的生存时间，称量肺、肝、脾质量，测算肺、肝、脾脏器指数，脏器指数（mg/g）=脏器质量（mg）/体质量（g）。

1.2.2 对迟发型超敏反应的影响参考文献方法[7]，取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量（20.0±1.2）g。小鼠腹部剪毛约4 cm2，适应环境后，按性别、体质量分层，随机分为5组，每组12只。连续给药10 d，阳性药物组为0.75 g/kg盐酸左旋咪唑片。给药第4天，将1%2，4-二硝基氯苯50μL均匀涂抹于腹部去毛部位，给药第9天，将1%2，4-二硝基氯苯10μL均匀涂抹于小鼠右耳双面进行攻击，攻击后24 h，处死，用直径8 mm的打孔器取下双侧耳片(取对称位置)，分别称其质量，以两耳片质量之差作为肿胀度。

1.2.3 对正常小鼠非特异性免疫功能的影响参考文献方法[8]155，取健康昆明种小鼠60只，雌雄各半，体质量（20.2±1.4）g。适应环境后，按性别、体重分层，随机分为5组，每组12只。连续灌胃给药10 d，阳性药物组为0.75 g/kg盐酸左旋咪唑。末次给药30 min后，称取体质量，尾静脉注射印度墨汁0.1 mL/10 g，注射后2 min（t2min）、20 min(t20min)分别从眼眶后静脉丛采血20μL，溶于2 mL，0.1%Na2C03溶液中摇匀，在波长610 nm下比色，测定光密度（以下分别用OD2min和OD20min来表示2 min和20 min所取血样的光密度）。取血完毕，用颈椎脱臼法处死小鼠，取其肝脏、脾脏，称质量。按下列公式计算廓清指数（K）及校正廓清指数（α）进行统计学计算。

1.2.4 对小鼠氨水引咳试验的影响参考文献方法[8]424，取健康昆明种小鼠足量，禁食不禁水12 h，置于500 mL烧杯中，在直径小于烧杯的表面皿内放一棉球，上面加盖筛网，向棉球中注入0.4 mL氨水（25%），迅速将烧杯倒置，使得氨水刺激小鼠引发咳嗽，以小鼠腹肌强烈收缩，同时张嘴呼气为准。以1 min内咳嗽次数大于或等于3次判定为引咳初筛合格。

取上述引咳初筛合格的小鼠60只，雌雄各半，体质量（20.1±1.2）g。按性别、体质量分层，随机分为5组，每组12只。连续灌胃给药10 d，阳性药物组为50 mg/kg枸橼酸喷托维林片。末次给药后30 min，依照上法以氨水刺激小鼠引发咳嗽。观察并记录各组小鼠引咳潜伏期（从倒置烧杯至发生咳嗽的时间），以及小鼠3 min内咳嗽次数，3 min内不咳者潜伏期以3 min计。

1.3 统计学分析

所有资料应用SPSS 16.0统计软件进行统计处理，采用“±s”表示，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 对结核杆菌感染动物死亡时间的影响

小鼠死亡时间观察结果显示，模型对照组小鼠感染人型结核杆菌（H37RV）后第15天开始出现死亡，至第23天实验结束时仅有1只小鼠存活。益肺通络颗粒不同剂量组小鼠存活时间均高于模型对照组，存活率分别达到16.7%、50.0%、83.3%，对人型结核杆菌（H37RV）感染小鼠具有明显的保护作用，且存在剂量等效关系。结果见表1。

表1 益肺通络颗粒对结核杆菌感染小鼠死亡时间的影响

2.2 对结核杆菌感染小鼠脏器指数的影响

各组小鼠肺、肝、脾脏器指数测算结果显示，小鼠感染人型结核杆菌（H37RV）后，肺、肝、脾脏器重量显著增加（P＜0.01），中、高剂量益肺通络颗粒对感染小鼠肺、肝、脾脏器均存在显著的保护作用（P＜0.01）。结果见表2。

表2 益肺通络颗粒对结核杆菌感染小鼠脏器指数的影响（±s）

注：与空白对照组比较##P＜0.01；与模型对照组比较**P＜0.01。

剂量（g/kg）组别空白对照组模型对照组益肺通络低组益肺通络中组益肺通络高组异烟肼组——6 12 24 0.75例数12 12 12 12 12 12肺脏指数5.24±0.66 8.82±0.82##8.67±0.56 8.01±0.65**7.31±0.35**7.11±1.16**肝脏指数5.13±0.81 8.29±0.75##8.06±0.85 7.43±1.03**6.49±0.86**7.13±1.10**脾脏指数0.37±0.07 0.52±0.09##0.48±0.06 0.43±0.10**0.36±0.07**0.37±0.05**

2.3 对迟发型超敏反应的影响

与模型组比较，中、高剂量益肺通络颗粒对小鼠耳肿胀度有显著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），说明其对小鼠迟发型超敏反应有较好的抑制作用。结果见表3。

表3 益肺通络颗粒对小鼠耳肿胀度的影响（±s）

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别模型组益肺通络低组益肺通络中组益肺通络高组左旋咪唑组剂量（g/kg）—6 12 24 0.75例数12 12 12 12 12肿胀度（mg）4.3±0.90 3.7±1.16 3.2±1.14*2.6±0.84**2.8±1.38**

2.4 对正常小鼠非特异性免疫功能的影响

与空白组比较，中、高剂量益肺通络颗粒小鼠炭粒廓清指数和校正廓清指数均显著高于空白对照组（P＜0.01），说明益肺通络颗粒能显著增强小鼠的非特异性免疫功能。结果见表4。

表4 益肺通络颗粒对小鼠炭粒廓清速率的影响（±s）

注：与空白对照组比较**P＜0.01。

组别空白对照组益肺通络低组益肺通络中组益肺通络高组左旋咪唑组剂量（g/kg）—6 12 24 0.75例数12 12 12 12 12廓清指数(k，×10-2)1.87±0.27 2.12±0.37 2.74±0.68**2.96±0.42**2.89±0.53**校正廓清指数(α)4.59±0.34 5.06±0.81 5.88±1.34**6.16±1.07**6.26±0.75**

2.5 对小鼠氨水引咳试验的影响

与模型组比较，中、高剂量益肺通络颗粒能显著延长小鼠氨水引咳的潜伏期（P＜0.05，P＜0.01），减少3 min内咳嗽次数（P＜0.05，P＜0.01），说明益肺通络颗粒具有较好的止咳作用。结果见表5。

表5 益肺通络颗粒对小鼠咳嗽次数的影响（±s）

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别模型组益肺通络低组益肺通络中组益肺通络高组左旋咪唑组剂量（g/kg）—6 12 24 0.75例数12 12 12 12 12引咳潜伏期(s)35.5±7.7 40.3±6.7 43.1±9.8*46.9±9.4**49.2±10.0**3 min咳嗽次数30.8±7.6 28.8±6.5 23.4±6.9*18.1±4.4**14.8±8.9**

3 讨论

临床研究和药理实验研究证明，很多单味中药本身就有不同程度的抗结核杆菌作用，如猫爪草、苦参、大蒜、狼毒、水车前、夏枯草、白及、百部、黄连、黄芩、苍术、淫羊藿、远志、北豆根、龙舌草、黄芪、冬虫夏草、葎草等[9-11]。“益肺通络方”以黄精、白及、太子参为方中主药，黄精补中益气、润心肺、强筋骨，白及收敛止血、消肿生肌、补肺，太子参补益脾肺、益气生津，现代药理研究表明三药对结核杆菌有抑菌作用，且黄精有增强免疫功能、抗衰老、抗疲劳、耐缺氧作用，尤擅长于肺结核治疗，体外试验其对结核杆菌有明显抑制作用。百部、矮地茶、紫花地丁、大蓟化痰、杀虫、消瘀、生新；天冬、款冬花、鳖甲清润肺气、滋阴软坚、增强免疫；丝瓜络通经络、和血脉、化痰顺气。上述诸药合用，共奏滋阴润肺、杀虫祛痰、化瘀生新之功。

研究报道中西药结合在控制肺结核临床症状(如咯血、咳嗽、发热)[12-13]、促进病灶吸收[14]、提高涂阳肺结核的转阴率[15]等方面比单用化疗药物效果好。另外，中西药结合能明显降低化疗药物的毒副作用，减轻肝功能损伤，防止血尿酸升高，提高患者的顺应性。对于耐药性肺结核的治疗，中西医结合也常可取得很好的疗效[15-16]。临床研究报道[17]“益肺通络方”联合化疗药物治疗耐多药肺结核在促进痰结核分枝杆菌阴转率、肺部病灶吸收有效率均优于单纯西药组，强化期影像学上均有不同程度的好转与吸收，药物不良反应较轻，患者可以耐受。可用于肺结核病Ⅲ型继发性肺结核（浸润性、慢性纤维空洞型）病，配合西药化疗减毒增效，减少耐药性，增强抗结核作用。

本实验结果表明，益肺通络颗粒对人型结核杆菌（H37RV）感染小鼠具有显著的保护作用，对氨水引起的小鼠咳嗽有显著的抑制作用。同时，能显著抑制小鼠迟发型超敏反应，增强小鼠的非特异性免疫功能。为有效控制益肺通络颗粒的质量，通过研究建立了益肺通络颗粒的质量控制方法，采用薄层色谱对黄精、紫花地丁和百部进行定性鉴别，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；采用高效液相色谱(HPLC)法对矮地茶中主要成分岩白菜素进行含量测定，含岩白菜素不少于1.25 mg/g[18]。

从益肺通络颗粒组方药物的文献资料来看，该方重在益气养阴、祛瘀通络、化痰止咳，对机体免疫功能有一定的增强作用。针对该方的药效学试验主要在验证其对于机体免疫功能的影响，止咳效果，以及其对于结核杆菌损害机体的保护作用，而没有进行该药体内抑菌作用的详细观察，所以第一项实验仅设计3 d给药，给药时间过短，且未进行脏器活菌检查以及肺脏病理学检查，仅从动物存活数和脏器指数观察了益气通络颗粒对于结核杆菌损害的保护作用。但该药体外试验显示有明显抑制结核分枝杆菌作用，且尤对耐多药结核分枝杆菌敏感[19]，是否可设计活菌培养计数法判断结核菌是否存活以及结核菌感染小鼠感染治疗作用的评价：肺组织匀浆培养；注射部位皮下结节、破溃；迟发性过敏反应或肺、肝、脾感染结核杆菌的病理表现等，来验证益肺通络颗粒抗结核作用，有待以后的研究证实。

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