医用小型猪骨加工工艺与免疫原性的检测与分析※

周小垚 顾翔风 柳伯安 孔繁平 赵 蓉 张继英 余奇文 张冬青

医用小型猪骨加工工艺与免疫原性的检测与分析※

周小垚1顾翔风1柳伯安1孔繁平1赵 蓉2张继英2余奇文2张冬青2

目的制备医用小型猪骨的浸出性异种蛋白，检测和分析其皮质和松质混合骨（以下简称混合骨）与单纯皮质骨（以下简称皮质骨）浸出性异种蛋白刺激和诱导人淋巴细胞增殖的应答反应。方法应用化学和物理学方法制备获得医用小型猪混合骨与皮质骨粉，以定量RPMI-1640搅拌和浸泡4℃ 72h后高速离心获取上清液且进行蛋白定量检测；随即应用CCK-8方法检测和分析混合骨与皮质骨浸出性异种蛋白刺激和诱导人外周血淋巴细胞增殖的差异性；以及人外周血淋巴细胞增殖培养上清中四种细胞因子表达的异同。结果CCK-8实验结果表明：CCK-8实验未见混合骨与皮质骨浸出性异种蛋白具有刺激和诱导人淋巴细胞增殖的应答反应的统计学差异；而应用ELISA酶联免疫吸附实验对人淋巴细胞培养上清中IFN-r、IL-1、IL-10和TNF-a的检测结果提示：与对照组相比，经工艺处理后小型猪骨组的四种炎症相关因子均较处理前组具有统计学的显著性差异（P＜0.05），而皮质骨组较混合骨组其炎症相关因子的表达同样具有统计学差异。结论本实验结果提示，应用已建立的小型猪骨加工工艺可有效处理和抑制异种蛋白对人淋巴细胞增殖的刺激和诱导作用，表明小型猪混合骨与皮质骨其异种蛋白的抗原性存在一定的差异；本小型猪骨加工工艺和免疫原性的检测和分析系统的建立为医用性异种骨的使用提供了理论与实验数据的参考。

小型猪；异种蛋白；抗原；CCK-8；酶联免疫吸附

近年来，小型猪作为医用材料特别是异种移植的供体具有许多优点，由于猪在心血管系统、消化系统、皮肤系统、骨骼发育、营养代谢等方面与人类具有较大的相似性，既能解决人源器官严重不足、提供源源不断的供体器官、组织、细胞，也可克服灵长类动物异种带来的伦理、烈性病毒传染病等问题，一直是人类异种移植的首选供体和研究开发的热点。其中，猪骨的研究作为人类骨的移植和替代更是迅猛发展[1-2]。本研究组多年来一直从事猪骨的生物学材料、力学、免疫学和病毒学的研究。特别是建立和建全了一套研制猪骨医用材料的生产和制备工艺；并且从生物力学、微生物与免疫学诸方面对生产和制备的猪骨材料进行了系统的检测与分析[3-5]；本文报告的是应用CCK-8和ELISA实验方法对本加工工艺制备的混合骨与皮质骨的免疫原性的差异性进行了初步的检测与分析。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

1.1.1 主要试剂制备工艺中原料除猪骨外无任何其它添加物，化学处理试剂为无水乙醇和乙醚两种，处理后均经过晾干挥发。

1.1.2 骨粉样本标识号混合骨粉：①-7,8,9：X111001/H-粉（处理前）、③-1,2,3：X111001/H-F（处理后）；皮质骨粉：②-10.11：X111001/P-粉（处理前）、④-4,5：X111001/YA-01（处理后）。

1.1.3 材料进口RPMI1640，0.22u过滤器，细胞培养液（含FCS），PHA，人骨粉浸出液，猪骨粉浸出液，蛋白定量试剂盒、3H-TdR，CCK-8Kit（日本），抗CD3-PreCP、CD4-FITC、CD8-PE荧光抗体标记物，抗CD16/56PE-CD3FITC荧光抗体标记物，96孔进口培养扳，淋巴细胞分离液等。

1.2 实验方法

1.2.1 小型猪骨的来源与获取小型猪骨选自上海浦东新区南汇老港镇华新特种养殖场[上海小型猪繁育与实验研究基地，许可证号SCXK（沪）2007-2013]提供的巴马小型猪，猪耳号01733575，雄性5月半，体重26kg。将小型猪在消毒治疗室中经麻醉处死后由专业取骨人员将除颅骨和趾骨外的其它骨骼剔取，置入消毒袋中，用低温转运箱运回公司冷藏。

1.2.2 小型猪骨生产工艺小型猪骨原料经-70℃以下深低温冷藏不少于2个月后出库经下列过程制备：于30万级净度车间中经常温纯水复温后，切除软组织和软骨；并按需要切割成形（骨块、骨条、骨粒）；置于冲洗器中用纯化水于高压下冲洗至外观白色或微黄，表面无血丝及其它附着物；经传递窗移入10万级净度车间中用纯化水漂洗数次至漂洗液清澈；用脱水乙醇和乙醚进行化学处理；晾干后经冻干机冷冻干燥48h后部分用粉碎机加工成颗粒状粉末供实验用；其余按上述规格用真空包装机按需进行三层包装；最后经辐照进行灭菌及病毒灭活处理。

1.2.3 小型猪骨粉异种蛋白浸出液制备称量待检无菌包装的小型猪骨粉样本，用无菌RPMI-1640定量浸泡4℃ 24h、48h、72h多个时间点以获得最佳浸泡时间（搅拌中），高速离心获取上清，经0.22u进口过滤器过滤分装和蛋白测定（分别用紫外或试剂盒测定上清液中蛋白含量）备用。

1.2.4 浸出液蛋白含量的蛋白定量试剂盒检测[6]蛋白质浓度测定（BCA法）BCA Kit：BD公司；每个样品取6μl＋水54μl，分2个复孔，每孔30μl，加入96孔板。按照96孔板每孔加试剂盒中A、B混合液240μl，其中A：B混合液配制体积＝50：1，37℃孵育30min后，在酶标仪上测浓度，按照标准曲线的浓度，计算检测样本蛋白含量。

1.2.5 CCK-8实验对浸出液蛋白诱导淋巴细胞增殖分析采用Dojindo公司的CCK-8试剂盒，取新鲜分离的PBMC，用10%FBS RPMI-1640培养液，计数调整细胞浓度为2×106/ml，加入96孔板，每孔2×105，然后再分别加入不同浓度骨蛋白浸出液，终体积200μl，每组的细胞接种5个复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养72h，取出100μl上清待检测细胞因子，余下的细胞内每孔补加培养液100μl。再每孔加入10μl的CCK-8溶液，混匀（加样时注意避免在孔中生成气泡而影响OD值的读数）。将96孔板在培养箱内孵育3h，用酶标仪测定450nm的OD值。

1.2.6 FACS对浸出液蛋白诱导淋巴细胞亚群表型分析[7]收集培养前后的细胞（106），RPMI 1640洗涤一次，弃去上清；用1ml RPMI-1640培养液重悬细胞，37℃、5% CO2环境中培养1h；PBS（含1% FBS）洗涤细胞，再用PBS（含1% FBS）洗涤两次，1%多聚甲醛固定，在流式细胞仪（BD FACS Calibur）检测。结果使用BD CELLQUEST软进行分析。

1.2.7 双夹心ELISA检测[8]浸出液蛋白诱导淋巴细胞培养上清中细胞因子首先加抗体（Ab-1）包被4℃过夜，洗涤3次、抛干，加待检细胞因子（Ag）37℃ 60min，洗涤3次、抛干，加用非同种动物生产的特异性抗体（Ab-2）37℃ 60min，洗涤3次、抛干，加入酶标抗Ab-2抗体（AB-3）37℃ 60min，洗涤3次、抛干，加底物液37℃ 20min，加终止液，用ELISA检测仪测定OD值。

1.3 统计学分析数值以均值±标准差（Mean± SD）来表示，使用Prism（GraphPad）软件进行统计分析。两组之间的差异作Student’s t检验，在进行双侧的配对或非配对Student’s t检验之前，以One-way ANOVA进行方差齐性分析。将P＜0.05视为有统计学差异并在图中进行标注（*,0.01＜P＜0.05；**,0.001＜P＜0.01；***,P＜0.001）。

2 结果

2.1 浸出液蛋白含量的UV和蛋白定量试剂盒检测见表1。

表1 待检样本分组与浸出液蛋白含量的检测(μg/ml)

2.2 CCK-8实验对浸出液蛋白诱导淋巴细胞增殖分析见表2。

表2 浸出液蛋白诱导人外周血淋巴细胞增值的(CCK-8)分析

由表2定量浸出液蛋白诱导人外周血淋巴细胞增值（72h，37℃，CO2）的（CCK-8）实验分析结果提示：显然处理前皮质骨和混合骨浸出液异种蛋白对人淋巴细胞的刺激指数较处理后皮质骨和混合骨浸出液异种蛋白对人淋巴细胞的刺激指数具有一定的差异，表明本小型猪骨生产工艺具有降低浸出液异种蛋白对人淋巴细胞刺激诱导作用（③④与①②比较）。

2.3 FACS对浸出液蛋白诱导淋巴细胞亚群表型分析图1的流式细胞仪检测了经处理前后的小型猪骨浸出液蛋白（72h，37℃，CO2）刺激后的T淋巴细胞亚群（CD3、CDR4和CD8）表型未见明显差异，其百分比含量呈正常比例分布。

图1 经浸出液蛋白刺激后的淋巴细胞亚群表型

2.4 双夹心ELISA检测浸出液蛋白诱导细胞培养上清细胞因子图2（A、B、C、D）为处理前、后的小型猪骨浸出液蛋白（72h，37℃，CO2）刺激人淋巴细胞增殖上清中细胞因子ELISA检测的分析结果。IL-10表达均低于处理前组。D经处理后皮质组和混合骨的细胞培养上清中TNFa表达均低于处理前组

图2 处理前后小型猪骨浸出液蛋白刺激人淋巴细胞增殖上清中细胞因子ELISA检测

3 讨论

同种异体组织和器官移植的供体来源有限，使异种移植再度成为研究热点。猪被认为是理想的供体之一[9]。异种移植的主要障碍为组织相容性的科学问题。越来越多的研究证明：某种异种蛋白（异种抗原）包括移植物中未被处理完全的异种动物细胞、血清成分、细胞因子和炎症因子以及多种靶抗原分子可被人血清中天然存在的抗体结合、激活补体导致超急排斥反应的发生，也可出现在移植物在受体中持续刺激和诱导宿主的免疫系统的T、B细胞和相关免疫活性细胞产生免疫应答而导致急性和慢性排除反应的发生[10-11]。

本小组先前已研究发现小型猪的SLA（MHC）A、B位点与人的HLA存在较大的差异，且不同种系小型猪也有一定的差异和突变体，因此异种移植，特别是小型猪的器官移植首要问题是清晰其的遗传背景，将来有望人们能用基因工程手段改造和解决这一障碍。现已有报道，猪的主要靶抗原为α-Gal，它的表达受α-1,3半乳糖基转移酶（α-GT）的控制[12]，还有一些抗原可与人血清抗体结合，如TNF诱导PAEC表达的gp65和gp100，猪组织表达的人血型抗原A等[13]。Minanov等[10]研究还发现异种移植后移植物中存在单个核细胞浸润，这些单个核细胞可能为NK细胞，T细胞和B细胞。这些免疫活性细胞在异种移植的免疫学研究中一直是人们关注的重要科学问题。

本研究小组一直致力于异种骨生产和临床应用的研究，从2008年开始着手对猪骨进行研究，当时向市场采购了部份猪骨生产样品后进行了免疫学检测，结果显示免疫原性符合用于人体的要求。为了能够满足产品的全面追溯要求，经研究组及骨科权威专家研讨后选择了特种小型猪。并委托农学院专家指定的养殖场养殖了一批猪种，目前已从部分小型猪切取骨原投入试生产并送至相关单位进行性能检测。现已具备了符合无菌医疗器械生产条件要求的生产厂房、仓库和产品检测实验室、检测仪器和植入性医疗器械生产必需的人力资源。建立和建全了异种骨研究平台，包括异种骨制备、生产后样品的力学、病毒学检测以及免疫学等多方面的分析和检测。本文研究表明，应用免疫学手段和方法可以获得较为稳定的小型猪骨的浸出性异种蛋白，其中包含了多种异种蛋白质抗原，同时提示本标准生产流程可显著祛除小型猪骨中的异种蛋白（CCK-8实验表明经处理后的小型猪骨浸出液中异种蛋白刺激淋巴细胞增殖反应具有一定的差异，且皮质骨较混合骨具有较强的诱导淋巴细胞增殖反应的能力）；图1的流式细胞术结果提示经处理的小型猪骨中的异种蛋白刺激诱导的人淋巴细胞形态和亚群比例未见明显差异，表明经处理后的小型猪骨对人淋巴细胞无毒副作用。

实验还提示，经处理前、后的小型猪骨中的异种蛋白刺激诱导的人淋巴细胞增殖上清液中的四种炎症因子（TNF-a、IL-1、IL-10和IFN-r）表明具有显著的统计学差异，进一步提示本标准生产流程可显著降低小型猪骨中的异种蛋白对淋巴细胞增殖上清中炎症因子的表达和含量，这些炎症因子可能与异种骨的移植的慢性排斥存在一定的关联性，值得关注。进一步完善和提高对小型猪骨的加工处理，特别是对皮质骨和混合骨的结构和力学以及免疫学的分析研究有助于提高本小型猪骨的生产工艺的优化和临床应用。

本文提示，应用已建立的小型猪骨加工工艺可有效处理和抑制异种蛋白对人淋巴细胞增殖的刺激和诱导作用，且表明小型猪混合骨与皮质骨其异种蛋白的抗原性存在一定的差异；本小型猪骨加工工艺和免疫原性的检测和分析系统的建立为医用性异种骨的临床应用提供了理论与实验数据的参考。

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The Machining Process of Medical Minipig-bone and the Detection and Analysis of Immunogenicity

Zhou Xiaoyao Gu Xiangfeng Liu Boan Kong Fanping Zhao Rong Zhang Jiying Yu Qiwen Zhang Dongqing

ObjectiveTo prepare the heterogeneous protein of medical minipig-bone, and detect and analyze the lymphocyte proliferation responses stimulated and inducted by the heterologous protein of cortical and cancellous mixed bone(hereinafter referred to as mixed bone)and cortical bone alone (hereinafter referred to as cortical bone).MethodsMedical minipig mixed bone and cortical bone meal were prepared by chemical and physical methods, stirred them with quantitative RPMI-1640 and soaked for 72 hours in 4℃, then supernatant was obtained by high-speed centrifugation followed by protein quantitative detection. Immediately the lymphocyte proliferation responses of human peripheral blood stimulated and induced by mixed and cortical bone heterogeneous protein were detected by CCK-8 kit, as well as the four kinds of cytokine expression in cultured serum.ResultsCCK-8 results showed that:the lymphocyte proliferation responses stimulated and induced by mixed bone and cortical bone had no statistical difference. Whereas ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for IFN-r, IL-1, IL-10 and TNF-a in human lymphocyte culture supernatant results showed that:compared with the control group, these four inflammation-related factors of minipig-bone treated group showed statistically significant difference after treatment(P＜0.05); meanwhile compared with mixed bone group, the expression of inflammation-related factors of cortical bone group also had significant difference.ConclusionThe results suggest that the application minipig-bone machining process which has been established can effectively handle and inhibit the role of heterologous proteins in stimulating and inducing lymphocyte proliferation response, and the heterogeneous protein antigenicity of minipig mixed bone and cortical bone have some differences. The establishment of the minipig-bone machining process and immunogenicitydetection and analysis system can be a reference of theoretical and experimental data for the use of medical xenograft bone.

Minipig; Heterogeneous protein; Antigen; CCK-8; ELISA

R392

A

1673-5846(2013)06-0135-05

1上海亚朋生物技术有限公司，上海 201203

2上海市免疫学研究所，上海 200025

国家自然基金（No.31270963），上海市科委重点（No.10JC1408500，No.10ZR1426100）项目资助