HPLC法同时测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱的含量

孙海涛

HPLC法同时测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱的含量

孙海涛

目的采用反相高效液相色谱法同时测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱的含量。方法使用Capcell C18 色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（PH3.0）（7：93）（磷酸盐缓冲液配制：准确量取磷酸二氢钾3.402g溶解于1000mL水中，用磷酸调PH值至3.0），流速为0.8mL•min-1，检测波长220nm，柱温为40℃。结果苦参碱和氧化苦参碱进样量在0.3118～4.6770μg和0.02976～0.44640μg范围内，线性关系良好；平均回收率（n=6）分别为97.1 %和98.4%，RSD分别为0.24%和1.48%。结论本法简便、准确，重复性好，可为清热通淋片的质量控制提供实验依据。

清热通淋片；苦参碱，氧化苦参碱；高效液相色谱法

清热通淋片主要成分是中药制剂，分别为苦参、爵床、硼砂、白茅根四种中药，或是含有提取物复方制剂，具有的临床作用是解热、利尿、通淋。较常用于下焦湿热所致热淋。症见：小便频急、尿道刺痛、尿液混浊、口干苦等，以及急性下尿路泌尿系统感染见于上述症状者。苦参中含有苦参碱、氧化苦参碱等生物碱类成分，具有清热燥湿、杀虫、利尿的作用[1]。苦参中生物碱含量测定方法包括比色法，薄层色谱扫描法和高效液相色谱法等[2]。近些年发表的应用高效液相色谱法的文章比较小，同时较多的文献应用C18色谱柱进行检测苦参碱含量等主要成分[3]或是应用氨基色谱柱同时检测氧化苦参碱含量和苦参碱含量，罕见应用C18色谱柱时进行氧化苦参碱及苦参碱文献的报道。本文中所参考的文献操作方法的流动相，选取用同时进行优化色谱，创建应用反相高效液相色谱法，应用C18色谱柱时进行氧化苦参碱的含量检测和复方制剂中苦参碱含量的检测。本方法操作简便，精密度好，结果准确可靠。

1 仪器与试药

岛津LC-2010高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样仪、真空脱气仪、柱温箱、Class VP色谱工作站、紫外检测仪），AE-160型电子分析天平，AG-135型电子分析天平，KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。对照品为氧化苦参碱（生产批号批号110780- 200506）和苦参碱（产品批号为110805-200306）在中国药品生物制品检定所采购；甲醇、磷酸均为色谱纯。采用其它试剂为分析纯，应用的水为超纯水。清热通淋片（规格：片芯重0.39g，江西杏林白马药业有限公司）。

2 方法及结果

2.1 对照品溶液配制方法准确量取15mg苦参碱作为对照品、准确量取8mg氧化苦参碱作为对照品，放置在10mL量杯内，加入适量的甲醇溶解同时稀释到预定刻数，搅拌均匀，准确称取5mL混合后对照品溶液，放置在25mL量杯内，用磷酸盐缓冲液（PH3.0）稀释至预定刻度搅拌均匀即可。

2.2 供试品溶液配制方法在进行供试品溶液配制时应去除包衣，准确称量研磨成细粉末，准确量取1.0g，放置在带有瓶塞的圆锥瓶中，准确量取50mL三氯甲烷加入，量取1mL浓氨试液加入置具塞锥形瓶中，密闭瓶塞充分搅拌均匀并且静止24小时以上，超声处理（功率500W，频率40kHz）30分钟，冷却再次进行称重，同时应用三氯甲烷充填补足缺少的剂量充分搅拌均匀，进行滤过。精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，立即取下，残渣加甲醇1mL使溶解，转移至l0mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液（PH3.0）稀释至预计刻度，充分搅拌均匀同时进行过滤，即可获得所需溶液。

2.3 阴性样品溶液配制方法准确量取苦参的阴性样品，同“2.2”项下方法操作，配制获得阴性样品溶液。

图1 HPLC色谱图

2.4 线性相关性分析精密量取对照品含量溶液剂量分别为1μL、3μL、5μL、10μL、15μL，依次注入相色谱仪内，同时进行峰面积的检测，同时横坐标为进样量（μg），纵坐标为峰面积值，并且进行标准曲线的绘制，苦参碱及氧化苦参碱的回归方程计算为Y＝1039908.67X+3976.03，r＝1.0000；Y＝1028954.62X-1574.89，r＝1.0000，实践结果显示：苦参碱进样量在0.3118μg～4.6770μg，氧化苦参碱进样量在0.02976μg～0.44640μg之间，同峰面积存在较好的线性相关。

2.5 精密度试验过程精确量取同种供试品的溶液，依据以上条件，反复进行6次检测，检测峰面积。结果显示苦参碱和氧化苦参碱峰面积的RSD（n=6）分别为0.84%，2.97%。试验结果证实精密度相对较好。

2.6 稳定性的试验过程精确量取同种供试品溶液，依据以上条件分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h进行精密检测，同时对氧化苦参碱和苦参碱和峰面积的 RSD（n=7）分别为1.21%和1.47%。因此结果表明12小时内的供试品溶液情况较为稳定。

2.7 重复性试验方法准确称取清热通淋片（批号20121101）2g，共6份，依据“2.2”项配制方法量取供试品溶液，依据以上条件进行检验。实践结果显示苦参碱和氧化苦参碱的含量相加和的平均值为（n=6）分别为1.1mg•mL-1，RSD分别为0.48%，表明此方法重复性较好。

2.8 回收率试验方法准确称取适量的清热通淋片（批号：20121101）粉末6份，每份0.5g，每份分别精密加入含苦参碱1.347mg·mL-1和氧化苦参碱0.194mg•mL-1的加入1mL对照品的甲醇溶液，依据“2.2” 项配制方法量取试验需要溶液，依据以上条件进行检验分析检测，计算和回收。

2.9 样品测定率结果苦参碱和氧化苦参碱的平均回收率（n=6）分别为97.1%和98.4%，RSD分别为0.24%和1.48%。

分别取不同批次的清热通淋片，依据“2.2” 项配制方法量取供试品溶液。精密量取5μL供试品溶液，依据以上条件进行检验分析检测，同时进行峰面积的测定，同时应用外标方法进行计算氧化苦参碱和苦参碱精确含量，实践结果分析显示3批样品含量为苦参碱和氧化苦参碱之和分别为1.14、1.13、2.37mg•mL-1。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

3.2 供试品制备方法的选择分别对采用光谱扫描针对氧化苦参碱和苦参碱进行检测，根据试验扫描结果显示，同时依据2010年版中国药典中的苦参药材含量检测波长[1]，故制定测定波长为220nm。

选用样品为浓氨试液-氯仿超声、盐酸-甲醇超声、浓氨试液-甲醇超声。实践结果证明，盐酸-甲醇超声扫描含有较多的杂质，不能正常进行分析；所以采用浓氨试液-甲醇超声提取的结果显示含量最高，但扫描含有较多的杂质，不能达到和接近标准基线分离；应用浓氨试液-氯仿超声扫描检测，可相对较高提取含量，同时在进行扫描检测时存在较少杂质，相对较好的样品分离度，因此采用浓氨试液-氯仿为标准的提取溶剂。

3.3 色谱柱的考察中国药典2010版一部中药材“苦参”含量测定项下采用氨基键合硅胶为填充剂的色谱柱同时测定苦参碱和氧化苦参碱[1]，氨基键合硅胶柱较少应用，推广起来受一定限制，并且试验结果表明，使用氨基键合硅胶柱出峰较快，难于分离成分复杂样品。故本文建立了一种全新的采用普通C18柱同时测定处方中苦参碱和氧化苦参碱的方法。

3.4 分离条件的选择采用C18色谱柱比较不同的流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（三乙胺调PH值至8.0）、乙腈-磷酸盐缓冲液（PH6.8）-三乙胺、甲醇-磷酸盐缓冲液（PH3.0）。结果表明，以甲醇-磷酸盐缓冲液（PH3.0）平衡时间短，分离效果佳，该流动相可使苦参碱和氧化苦参碱均能达到基线分离。

3.5 选择进样量的方法因供试品溶液的流动相和极性的极性存在比较大差异性，过大的进样量会导致峰型较差，发生分裂及峰变宽，过小的进样量会导引起不准确的进样，因此5μL为标准的进样量定最为合适。

3.6 小结本方法可以采用普通C18色谱柱准确、灵敏的同时测定清热通淋片中苦参碱和氧化苦参碱这两种生物碱的含量，苦参碱和氧化苦参碱均能达到基线分离，重复性及回收率较好，结果可靠，为清热通淋片的质量标准的建立提供了依据。

[1] 中华人民共和国卫生部.中国药典2010年版一部[S].北京：人民卫生出版社,2010：188.

[2] 蒋珍藕.苦参碱的提取工艺及测定方法的研究进展[J].中医药导报,2005,11(08)：90.

[3] 中华人民共和国卫生部.中国药典2005年版一部[S].北京：人民卫生出版社,2005：497.

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1673-5846(2013)06-0202-04

吉林省食品药品检验所，吉林长春 130033