18F-SFB-Annexin B1探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究

复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

18F-SFB-Annexin B1探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究

郑宇佳 王明伟 张建平 徐俊彦 杨忠毅 程竞仪 张勇平 章英剑

复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

背景与目的：诱导细胞凋亡是肿瘤化疗的机制之一，分子影像能在活体内无创、动态地检测细胞凋亡，有助于药物筛选和疗效分析。本研究旨在探讨N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯偶联的氟-18-膜联蛋白B1(18F-SFB-AnnexinB1)显像剂早期评价化疗诱导细胞凋亡的可行性。方法：以SFB作为中间体将18F标记到AnnexinB1上。了解18F-SFB-Annexin B1在健康小鼠体内的生物分布特性。建立Walker-256荷瘤小鼠模型，随机分为两组，化疗组腹腔注射环磷酰胺(CTX 200 mg/kg，n=3)，对照组注射等体积无菌0.9%的氯化钠溶液(n=3)。24 h后静脉注射18F-SFB-Annexin B1，分别于注射后1、2、3、4 h进行PET/CT显像。比较肿瘤/肌肉放射性摄取率比值(T/M)与原位缺口末端标记(TUNEL)染色法测定凋亡指数(AI)的关系。结果：18F-SFBAnnexin B1放化纯度＞95%，生物分布显示肾脏放射性最高，其次为肝、脾和心肌，显像剂在体内清除速率快。化疗组与对照组各时间点T/M比值分别为4.38±0.56、6.75±1.16、6.44±1.12、4.81±0.17和2.35±0.14、2.99±0.55、3.04±0.41、2.33±0.47，差异有统计学意义(F分别为23.790、16.913、14.046、77.517，P均＜0.05)。TUNEL染色AI分别为(21.00±0.04)%和(8.58±0.01)%，差异有统计学意义(F=21.539，P＜0.05)，且T/M值与AI间有很好的相关性(r=0.91，P＜0.05)。结论：18F-SFB-AnnexinB1能早期反映化疗诱导的细胞凋亡，有望用于活体细胞凋亡分子显像和早期疗效判断。

膜联蛋白B1；凋亡；放射性核素显像；化学疗法；疗效评价

位于细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸(PS)翻转到细胞膜表面是凋亡发生的特征之一，膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)是膜联蛋白家族中的一员，具有Ca2+依赖性PS结合活性，可以反映凋亡，在监测神经元退行性变、心脑血管缺血-再灌注损伤、移植器官排斥反应和评价肿瘤治疗疗效等方面具有良好应用前景［1-7］，其中99mTc-AnnexinⅤ已进入临床研究，用于头颈部肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌和肺癌等恶性肿瘤疗效评价［8-10］，是目前应用最多的SPECT细胞凋亡显像探针。

Annexin B1是膜联蛋白家族新成员，由我国科学家孙树汉教授等首次克隆成功［11］。99mTc-Annexin B1在小鼠胸腺、肝脏凋亡模型中均能良好地显示凋亡，结果与原位缺口末端标记法(TUNEL)检测一致［12-13］。

本研究在18F标记Annexin B1、体外探测anti-Fas抗体诱导Jurkat细胞凋亡和体内探测家兔肾脏缺血-再灌注损伤凋亡基础上［14］，进一步探讨其评价肿瘤化疗后凋亡的可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性昆明小鼠(n=12，20～25 g)用于生物分布实验，雄性SD大鼠(n=6，180～200 g)用于荷瘤模型制备。所有实验动物均购于复旦大学实验动物科学部。

1.2 仪器和试剂

Annexin B1由上海第二军医大学医学遗传学教研室提供。医用回旋加速器、正电子药物合成仪和显像设备均为德国Siemens制造，型号分别为RDS Eclipse ST、Explora GN和Biograph 16HR，γ计数器为上海核所日环光电仪器有限公司SN-695B型，TUNEL试剂盒、环磷酰胺(CTX)分别购自德国Merck和Baxter Oncology GmbH公司。

1.3 实验方法

1.3.118F-Annexin B1标记

根据文献［15-16］的方法制备。通过耦合剂N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯(N-succinimidyl-4-fluorobenzoate, SFB)将18F标记到Annexin B1上，检测其标记率、放射化学纯度和稳定性。

1.3.2 正常小鼠体内生物分布

昆明小鼠随机分为4组，每组3只。尾静脉注射0.74 MBq(0.4 mL)/只18F-SFB-Annexin B1，分别于注射后0.5、1、2、4 h取各主要脏器称重、放射性计数，计算每克组织百分注射率(%ID/g)。

1.3.3 化疗诱导肿瘤凋亡

抽取Walker-256癌肉瘤腹水种鼠淡黄色浑浊腹水，经0.9%的氯化钠溶液1∶1稀释后，以1 mL/只接种于小鼠右侧腋窝处皮下。待肿瘤长至直径1 cm时，随机分为化疗组和对照组，每组各3只。化疗组小鼠腹腔注射CTX (200 mg/kg)，对照组小鼠注射等体积无菌0.9%的氯化钠溶液，24 h后进行18F-SFB- Annexin B1 PET/CT显像。

1.3.4 荷瘤大鼠凋亡显像

荷瘤大鼠尾静脉注射3.7 MBq(0.5 mL)/只18F-SFB-Annexin B1，10 min后腹腔注射1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉。分别于注射显像剂后1、2、3、4 h进行PET/CT静态显像。1个床位/只大鼠，每个床位采集10 min，图像分析采用感兴趣区(region of interest，ROI)技术，取右侧腋窝肿瘤部位和同层面对侧上肢肌肉组织作为ROI，分别测量两者最大标准摄取值(maximum standard uptake value，SUVmax)，计算肿瘤与肌肉SUVmax之比(即T/M)。

1.3.5 TUNEL检测细胞凋亡

显像结束后立即处死小鼠，取肿瘤组织4%甲醛溶液中固定，24 h后石蜡包埋、切片，每片厚4 μm。每个样品取2张相邻切片按试剂盒说明书进行TUNEL法检测，以细胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞。每张切片随机选取5个视野(×200)，计数凋亡细胞数占细胞总数百分比作为凋亡指数(apoptosis index，AI)，以AI反映各组肿瘤细胞凋亡情况。

1.3.6 统计学处理

数据分析采用SPSS 17.0统计软件。计量数据均用x±s 表示，组间比较采用one-way ANOVA， T/M值与AI值作直线相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.118F-SFB-Annexin B1的质量

产物标记率(27.8 ± 6.9)%(n=5)，放射化学纯度(96.4 ± 1.3)%(n=5)，分别在小牛血清和PBS体系内室温放置3个半衰期(6 h)，放射化学纯度仍＞90%。

2.2 正常小鼠体内生物分布

小鼠18F-SFB-Annexin B1体内生物分布情况(表1)。肾脏放射性最高，其次为肝脏、脾脏及心肌，2 h时上述脏器放射性摄取率均降至较低水平，显像剂主要经泌尿系统排泄。血液中放射性清除速率快，30 min时即可降至(0.198 4±0.110 0)%ID/g，其余脏器各时间点放射性摄取率变化不明显。

2.3 荷瘤大鼠活体显像

Walker-256癌肉瘤腹水接种成瘤率100%。两组荷瘤大鼠尾静脉注射18F-SFB-Annexin B1 1、2、3、4 h后的PET/CT图像均见肿瘤显影，内部坏死灶因无血液供应呈放射性分布缺损(图1)。化疗组1、2、3、4 h的T/M值分别为4.38±0.56、6.75±1.16、6.44±1.12和4.81±0.17，对照组为2.35±0.14、2.99±0.55、3.04±0.41和2.33±0.47，差异有统计学意义(F分别为23.790、16.913、14.046、77.517，P均＜0.05)。1 h时肿瘤显影最明显，但软组织本底亦较高，肝脏、脾脏、肾脏和膀胱清晰显影，2～3 h时软组织本底放射性逐渐清除，T/M值升高，且肝脏、脾脏放射性摄取程度明显减低，肾脏和膀胱全程均见显影。

图 1 荷Walker-256癌肉瘤大鼠PET/CT凋亡显像Fig. 1 PET/CT apoptosis imaging of Walker-256 bearing rat

表 118F-SFB-Annexin B1在正常小鼠体内分布Tab. 1 Biodis ion of18F-SFB-Annexin B1 in normal mice

2.4 TUNEL检测细胞凋亡

TUNEL染色观察到化疗组小鼠有大片黄染颗粒，表明存在大量凋亡细胞，对照组肿瘤亦有较多黄染颗粒，提示存在一定程度的自身凋亡(图2)。但化疗组AI为(21.00±0.04)%，对照组为(8.58±0.01)%，差异有统计学意义(F=21.539，P＜0.05)。表明经CTX处理24 h后，肿瘤细胞凋亡数量明显增加。T/M比值与AI间有很好的正相关性(r=0.91，P＜0.05)。

图 2 肿瘤凋亡TUNEL检测Fig. 2 TUNEL detecting

3 讨 论

PS外翻发生在凋亡形态学改变之前，为早期检测细胞凋亡提供了有效靶点。传统检测细胞凋亡的方法大都属于有创检查，且不能连续、动态监测凋亡在活体内发生、发展和转归过程，难以直观评估疗效，临床实际应用价值有限。因此，应用现代影像示踪等技术进行活体监测凋亡已经成为生命科学领域的热点问题［17-21］，其中使用放射性核素标记膜联蛋白的应用报道最多。

国内外学者已经在99mTc-AnnexinⅤ监测细胞凋亡方面做了大量研究,取得很好的结果，并应用于多个临床试验中。但SPECT空间分辨率较低、产物体内生物分布不理想是其未在临床广泛应用的重要原因。PET/CT是目前医学影像领域先进的分子功能显像技术，应用正电子核素(如18F)标记AnnexinⅤ所获得的产物进行PET显像可以明显提高影像质量。Murakami等［21］比较18F-SFB-AnnexinⅤ和99mTc-HYNICAnnexinⅤ在正常大鼠和心肌缺血模型大鼠体内生物分布发现，凋亡心肌摄取两种显像剂均是正常心肌的3倍，但前者在肝、脾和肾的分布明显低于后者。本研究中使用［18F］SFB作为标记中间体，成功制备18F-SFB-Annexin B1，产物具有良好的体外稳定性和放化纯度，生物分布结果显示，18F-SFB-AnnexinB1在小鼠肾脏分布最高，其次为肝、脾和心肌，但均低于99mTc-Annexin B1［12］。因此，本研究的18F-SFBAnnexin B1可能较99mTc- AnnexinⅤ和99mTc- AnnexinB1更适合应用于临床凋亡显像，尤其是对腹部凋亡病灶检测更具优势。此外，本研究靶/本底比值是99mTc-HYNIC-annexinⅤ检测荷瘤鼠单次化疗24h后靶/本底比值的2～3倍［22］(4.4～6.4 vs 2.1～2.5)，提示18F-SFB-Annexin B1的图像质量较好，凋亡诱导模型也较为理想。

放疗、化疗早期即可诱导肿瘤细胞凋亡，早期、无创、动态地观察治疗后凋亡发生情况，对肿瘤治疗疗效监测、临床个体化治疗方案制定和调整、预后判断和新药研发等都有十分重要的意义。考虑到化疗可操作性强，本研究采用单次大剂量腹腔给予CTX作为诱导凋亡的方法，结果提示凋亡诱导较为理想，与对照组自身的凋亡现象存在差异。

细胞凋亡发生后会出现2个PS高峰，分别在1～5 h和9～24 h，仅后者与凋亡有关［7］。因此，选择在CTX处理24 h后进行PET/CT显像，结果化疗组肿瘤摄取显像剂程度和TUNEL检测阳性率均高于对照组的2倍，且两者具有良好的正相关。注射显像剂1 h后肿瘤显影最明显，轮廓清晰(图1)，但该时间点肝、脾、肾和膀胱放射性均较高，不利于对腹盆腔病灶的评估。对于腹盆腔以外病灶，该时间点T/M值较高，可作为局部疗效评价较为适宜的显像时间。随着药物在体内代谢，放射性在各主要脏器逐渐清除，2 h时可见肝、脾放射性分布明显减低，因此该时间点可以作为腹腔病灶或全身疗效评价的适宜显像时间。本研究进行了1～4 h显像，可见膀胱在显像全程均显影，这可能会影响对盆腔病灶疗效判断的准确性。对此，临床可以尝试使用利尿药物、导尿或者大量饮水等方法加速膀胱内放射性尿液的排泄来配合凋亡显像，从而提高检出率。

有效的放化疗在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，还可诱发一定量的肿瘤细胞坏死，后者细胞膜的通透性明显增高，继而发生裂解，暴露于细胞基质中的PS亦可以与膜联蛋白结合，从而干扰凋亡显像效果。Van De Wiele等［7］对20例头颈部鳞癌患者进行99mTc-HYNIC-rh-annexinⅤ凋亡显像结果证实，只有在缺乏坏死的情况下，肿瘤组织对显像剂的摄取才与TUNEL检测阳性率正相关。自噬是一种Ⅱ型程序性细胞死亡，是一个细胞通过溶酶体降解作用清除衰老、受损或多余的线粒体或其他细胞器的过程［23］，以出现双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为特征。某些情况下，诱导自噬可以抑制肿瘤生长，并致自噬相关性细胞死亡，但大多数情况下，肿瘤细胞可利用自噬应对缺氧、营养匮乏，能清除氧自由基、损伤的线粒体，从而保护肿瘤细胞。因此，在凋亡显像研究中还要注意识别细胞坏死和自噬现象。

本研究是在小动物PET/CT引进之前的结果，随着本科室小动物显像设备的应用，18FSFB- Annexin B1在凋亡检测中的价值会得到更好的体现。另外，大分子蛋白在体内的生物分布劣于小分子化合物，我们今后的研究将致力于标记Annexin B1蛋白功能片段。

综上所述，18F-SFB- Annexin B1能够反映化疗诱导下的肿瘤细胞凋亡，有望成为临床PET/ CT监测细胞凋亡的分子影像探针。

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《中国癌症杂志》举办继续教育函授班通知

经本刊编委会讨论决定，本刊从2013年下半年起举办2014年度继续医学教育函授班：

一、2013年第8期起开设2014年度函授继续医学教育专栏，本年度的主要内容包括：胰腺癌、食管癌、胃癌的病理诊断、放射治疗及内外科治疗等。每期刊登1讲，共12讲，2014年第8期刊登考试试题，第9期刊登正确答案，要求学员认真阅读讲座后答题，并将答案寄至编辑部（复印无效），考卷经专人统一审阅，合格者授予Ⅱ类继续教育学分10分，学分证书由复旦大学附属肿瘤医院颁发。

二、参加对象：所有正在从事医学专业技术工作的卫生技术人员。预参加者请写好本人姓名、年龄、性别、职称、职务、学历、选派单位名称（地址及邮政编码）、所在科室、联系电话等寄往本编辑部（E-mail：zgaz@chinajournal.net.cn；zgazzz@163.com），同时通过邮局汇款（单位名称：《中国癌症杂志》编辑部；地址：上海市徐汇区东安路270号）的方式支付函授教育费，并请在汇款备注中注明“2014年度函授继续教育”。编辑部收到学员报名和函授教育费后编号登记注册，随即寄出注册费发票，并按时寄上每期刊物。即日起开始报名。

三、学员每人收费200元，赠送12期杂志。编辑部依据学员报名登记注册编号、交费记录和考试成绩于2014年10月30日以前寄发学分证书。

四、编委会邀请有关专家进行出题、阅卷工作，并设专人负责。电话：021-64188274；传真：021-64043766；邮编：200032；联系人：王露。欢迎广大医务人员踊跃参加。

Experimental study on tumor response to chemotherapy with 18F-SFB-Annexin B1

ZHENG Yu-jia, WANG Ming-wei, ZHANG Jian-ping, XU Jun-yan, YANG Zhong-yi, CHENG Jing-yi, ZHANG Yongping, ZHANG Ying-jian (Department of Nuclear Medicine, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

ZHANG Ying-jian E-mail: yjzhang111@Yahoo.com.cn

Background and purpose: One of the main mechanism of chemotherapy is inducing tuomr apoptosis. Molecular imaging can allow noninvasively and dynamically monitor tumor apoptosis in vivo, and help to drug screening and therapeutic evaluation. The purpose of this study was to evaluate the feasibility of18F-SFB-Annexin B1 in detecting apoptosis at an early phase after chemotheraphy. Methods: Annexin B1 was labeled with18F using SFB as a chelating agent. Tissue distribution of18F-SFB-Annexin B1 was studied in healthy mice by the dissection method. W256 tumor-bearing rats were injected with18F-SFB-Annexin B1 intravenously at 24 h after the treatment of cyclophosphamide (CTX 200 mg/kg) or saline. Then imaging was acquired at 1, 2, 3, and 4 h postinjection on a PET/ CT, and the tumor-to-muscle ratio of SUVmax(T/M) and the AI from TUNEL testing were compared. Results:18F-SFBAnnexin B1 had a radiochemical pruity (RCP)＞95%. Biodistribution of this probe showed a predominant uptake in the kidney, then was liver, spleen, and myocardium, rapid clearance from blood and urinary was observed. The radios of T/M were 4.38±0.56, 6.75±1.16, 6.44±1.12, 4.81±0.17, respectively at 1, 2, 3, 4 h post injection of the chemotherapy group, much higher than that of the saline group (2.35±0.14, 2.99±0.55, 3.04±0.41, 2.33±0.47, respectively). The differences between the two groups were significant (F=23.790, 16.913, 14.046, 77.517, respectively, all P＜0.05). TUNEL staining revealed that chemotherapy treatment significantly increased the percentage of apoptosis cells with anAI of (21.00±0.04)% in the chemotherapy group, higher than that in the saline group (8.58±0.01)%, the difference was significant (F=21.539, P＜0.05). The radios of T/M were significantly correlated with the values of AI (r=0.91, P＜0.05). Conclusion:18F-SFB-Annexin B1 can be used to apoptosis imaging and early therapeutic evaluation in vivo because it can reflect apoptosis at an early stage after chemotheraphy.

Annexin B1; Apoptosis; Radionuclide imaging; Chemotherapy; Response evaluation

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.004

R73-36

：A

：1007-3639(2013)10-0798-06

2012-12-31

2013-07-17）

章英剑 E-mail:yjzhang111@Yahoo.com.cn