多柔比星诱导乳腺癌细胞PARP-1活性上调依赖于Kif4A蛋白低表达

苏州大学附属第三医院病理科，江苏 常州，213003

多柔比星诱导乳腺癌细胞PARP-1活性上调依赖于Kif4A蛋白低表达

王辉 鲁常青 田波 李青 陈铜兵

苏州大学附属第三医院病理科，江苏 常州，213003

背景与目的：化疗作为乳腺癌术后治疗的重要手段，由其引发的耐药现象备受关注，而耐药的出现与DNA损伤修复异常增强密切相关。驱动蛋白家族成员4A(kinesin family member 4A，Kif4A)和聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP-1]是重要的DNA损伤修复分子。本研究探讨Kif4A在多柔比星诱导乳腺癌细胞PARP-1活性上调中的作用及意义。方法：蛋白质印迹法检测多柔比星处理后乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞Kif4A蛋白表达及PARP-1活性的变化；并检测高表达Kif4A蛋白后，乳腺癌细胞PARP-1蛋白表达及其活性变化；流式细胞技术检测多柔比星联合PARP-1抑制剂3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-ABA)干预后乳腺癌细胞的凋亡情况。结果：多柔比星能上调PARP-1活性并诱导乳腺癌细胞Kif4A蛋白低表达，两者都呈浓度和时间依赖性；高表达Kif4A后，PARP-1活性被明显抑制，细胞凋亡数增加，而多柔比星能部分逆转由Kif4A高表达而引起的PARP-1活性抑制。多柔比星和3-ABA都诱导乳腺癌细胞凋亡，联合使用能增加细胞凋亡，与单独使用比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果还显示，多柔比星、PARP-1抑制剂3-ABA及高表达的Kif4A诱导的MDA-MB-231细胞凋亡数高于MCF-7细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：多柔比星诱导乳腺癌细胞PARP-1活性上调依赖于细胞Kif4A蛋白低表达，Kif4A有望成为逆转多柔比星耐药的新靶点。

驱动蛋白家族成员4A；聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1；多柔比星；MCF-7细胞；MDA-MB-231细胞

多柔比星是临床上常用的化疗药物，能与DNA发生交联，抑制DNA复制，阻断细胞分裂，达到杀伤肿瘤细胞的目的。然而最近临床用药显示，多柔比星的化疗特别是对乳腺癌的化疗耐药现象常见，而化疗耐药原因可能与肿瘤细胞DNA损伤修复能力异常增强有关。聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1［poly(ADP-ribose) polymerase，PARP-1］在DNA损伤修复中起着重要作用。研究发现多柔比星能上调多种乳腺癌细胞PARP-1的活性［1-2］。本研究通过实验证明驱动蛋白家族成员4A(kinesin family member 4A，Kif4A)在多柔比星诱导乳腺癌细胞PARP-1活性上调中起着重要作用，为乳腺癌耐药研究提供线索。

1 材料和方法

1.1 细胞及试剂

1.1.1 细胞株

乳腺癌细胞MCF-7购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，乳腺癌细胞MDAMB-231购于南京凯基生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

DMEM细胞培养液购于Invitrogen公司；胎牛血清购于美国Hyclone公司；一抗Kif4A多克隆抗体和PAR多克隆抗体购于SAB公司，PARP多克隆抗体和α-tubulin多克隆抗体购于Cell Signaling公司；二抗HRP标记的羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗购于Amersham公司；多柔比星购于美国Sigma公司；PARP-1抑制剂3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide，3-ABA)购于Amresco公司；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物有限公司。

1.2 细胞培养

MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞均用含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM完全培养液，于37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养，每2～3天用0.25%胰蛋白酶和0.5% EDTA混合液传代。

1.3 实验分组及细胞处理

接种MCF-7和MDA-MB-231细胞(MCF-7细胞接种密度为3×105个细胞/孔，MDA-MB-231细胞接种密度为5×105个细胞/孔，下面实验细胞接种密度与此相同)于6孔板中，次日换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养液2 mL，分别用0.05、0.1、0.5、1、2 μmol/L的多柔比星处理MCF-7细胞24 h，恢复12 h，裂解细胞，收集蛋白，备用与蛋白印迹法检测。以不加多柔比星细胞为对照组(0 μmol/L)。每组设3个重复孔。

1 μmol/L浓度多柔比星处理MCF-7/MDAMB-231细胞24 h，分别在恢复6、12、24和48 h后，用PBS洗细胞2次，裂解细胞，收集蛋白，并进行蛋白定量，备用与蛋白印迹法检测。以不给予恢复时间细胞组为对照组。每组设3个重复孔。

构建并转染HA-Kif4A质粒至MCF-7和MDA-MB-231细胞中，1 μmol/L浓度的多柔比星处理24 h，恢复12 h，裂解细胞，收集蛋白，并进行蛋白定量，备用与蛋白印迹法检测。以转染空载质粒和未加多柔比星细胞组为对照组。每组设3个重复孔。

接种MCF-7/MDA-MB-231细胞，用1 μmol/L浓度的多柔比星联合5 μmol/L浓度的3-ABA分别处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h，恢复12 h，收取上清液及培养皿底部贴壁细胞，用PBS洗涤2次，用FCM法检测细胞凋亡。以不加多柔比星和3-ABA的MCF-7细胞组为对照组。每组设3个重复孔。

1.4 蛋白质印迹法(Western blot)

Western blot检测Kif4A、PARP-1的表达及PARP-1的活性，用细胞裂解液提取各组总蛋白；考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量，取等量蛋白进行8%的SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，非特异性封闭；加入抗Kif4A多克隆抗体、抗PARP-1多克隆抗体、抗PAR多克隆抗体及抗α微管蛋白多克隆抗体，4 ℃过夜；加入辣根过氧化物酶标记的相应的二抗进行杂交2 h。ECL发光剂温浴5 min，曝光、显影、定影。用α微管蛋白作为内参。数码成像分析系统软件对结果进行分析，用Image-Pro Plus 6.0软件对蛋白条带进行光密度分析，目的蛋白的相对表达量=(待检测蛋白光密度/α微管蛋白光密度。实验重复3次。

1.4 RT-PCR检测

提取HEK293(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)细胞总RNA，并以其为模板，扩增Kif4A；Kif4A引物序列：上游5’-TGAAGC TTACATGAAGGAAGAGGTGAAG-3’；下游5’-AGATGTCGACTCCAACTTCAGTGGG-3’，反应条件94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃4.5 min，30个循环；72 ℃ 5 min 。

1.5 FCM法检测细胞凋亡

按实验要求处理MCF-7和MDA-MB-231细胞，用不含EDTA胰酶消化收集细胞，合并上清液和细胞，用PBS再洗涤2次，然后用500 mL结合缓冲液悬浮细胞，加入5 mL的AnnevinⅤ-FITC混匀，加入5 mL的PI混匀，室温避光反应5～15min，流式细胞仪检测(1 h内完成细胞检测)。计算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.6 统计学处理

应用SPSS 17.0统计分析软件进行实验结果数据处理，计量资料以x±s 表示，两组间均数的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析，再用Tukey post hoc进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 多柔比星对乳腺癌细胞MCF-7和MDAMB-231表达Kif4A和PARP-1的影响

分别用0.05、0.1、0.5、1和2 μmol/L浓度多柔比星干预MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h，恢复12 h，以不加多柔比星细胞为对照组(0 μmol/L)，蛋白质印迹法检测结果显示，随着多柔比星浓度的升高，MCF-7和MDA-MB-231细胞PARP-1活性即多聚核糖基化修饰［poly(ADP-ribose)，PAR］在整个过程中逐渐增强，在1 μmol/L时，其活性是对照组(0 μmol/L)的2倍以上，差异有统计学意义(P＜0.05)；相反Kif4A蛋白却呈现出逐渐低表达，在多柔比星浓度为1 μmol/L时，Kif4A蛋白基本不表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；而全长PARP-1(113×103)蛋白表达在整个过程中变化不大，其断裂(89×103)略有减少(图1)。

1 μmol/L浓度多柔比星处理MCF-7细胞24 h，分别恢复6、12、24、48 h，以未处理组和不予恢复时间作为对照组，蛋白质印迹法检测结果显示，多柔比星处理后随着恢复时间的延长，两种细胞的PARP-1活性PAR都呈现出逐渐增加的趋势，在多柔比星处理后不予恢复时间组中PAR被抑制，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；相反Kif4A蛋白却呈现出逐渐低表达，差异有统计学意义(P＜0.05)；而全长PARP-1蛋白表达在整个过程中变化不大，随着恢复时间的延长，断裂PARP-1略有减少，与加入多柔比星但不予恢复时间组相比较，给予恢复时间组PARP-1断裂减少，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

2.2 Kif4A高表达对MCF-7和MDA-MB-231细胞表达PARP-1及其活性的影响

图 1 蛋白质印迹法检测不同浓度多柔比星处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h且恢复12 h后Kif4A及PARP-1的表达情况Fig. 1 The expressions of Kif4A and PARP-1 after treatment with epirubicin for 24 h, and recovery for 12 h were detected by Western blot in MCF-7 and MDA-MB-231 cells.

图 2 蛋白质印迹法检测1 μmol/L浓度多柔比星处理MCF-7细胞24 h，恢复不同时间后Kif4A及PARP-1的表达情况Fig. 2 The expression of Kif4A and PARP-1 after treatment with 1 μmol/L epirubicin for 24 h and recovery for different time were detected by Western blotting in MCF-7 and MDA-MB-231 cells

构建HA-Kif4A(结果未显示)，转染HAKif4A至MCF-7和MDA-MB-231细胞内，1 mmol/L浓度多柔比星处理24 h，恢复12 h，裂解细胞，蛋白质印迹法检测结果显示：Kif4A的高表达能明显抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的PARP-1活性，与未转染组和转染空载体组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)，而多柔比星能部分逆转由外源性Kif4A高表达引起的PARP-1活性抑制；多柔比星处理组PARP-1活性明显增强，与不加多柔比星相比，差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

2.3 多柔比星联合3-ABA作用对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响

图 3 蛋白质印迹法检测Kif4A高表达后1 μmol/L浓度多柔比星处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h、恢复12 h后PARP-1蛋白表达或活性的情况Fig. 3 The expression of PARP-1 after transfected HA-Kif4A plasmid and treated with 1 μmol/L epirubicin for 24 h and recovery for 12 h by Western blot in MCF-7 and MDA-MB-231 cells

用1 mmol/L浓度多柔比星联合5 mmol/L浓度3-ABA处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h，恢复12 h，收取上清液及培养皿底部贴壁细胞，用PBS洗涤2次，以不加多柔比星和3-ABA为对照组，FCM法检测细胞凋亡，结果显示，在MCF-7细胞，多柔比星及3-ABA都能诱导MCF-7细胞发生凋亡，细胞凋亡率分别为(5.94±0.27)%和(6.90±0.17)%，与对照组 ［(3.85±0.26)%］相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；两者联合使用能进一步诱导细胞凋亡，凋亡率为(10.24±0.81)%，与多柔比星及3-ABA单独使用相比，差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

多柔比星及3-ABA都能诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡，细胞凋亡率分别为(6.30±0.48)%和(7.83±0.58)%，与对照组［(3.14±0.67)%)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；两者联合使用则进一步诱导细胞凋亡，凋亡率为(11.53±0.45)%，与多柔比星和3-ABA单独使用相比，差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

本研究同时还比较了多柔比星及3-ABA处理后，MCF-7与MDA-MB-231细胞的凋亡差异，结果显示：多柔比星、3-ABA、多柔比星+3-ABA处理后，MDA-MB-231细胞凋亡率分别为(6.30±0.48)%、(7.83±0.58)%和 (11.53±0.45)%，显著高于MCF-7细胞相对应处理组，差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

2.4 Kif4A高表达对多柔比星诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响

图 4 FCM法检测多柔比星联合3-ABA对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡影响Fig. 4 The apoptosis of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treated with PARP-1 inhibitor 3-ABA and epirubicin were detected by FCM

转染HA-Kif4A至MCF-7和MDA-MB-231细胞内，1 mmol/L浓度多柔比星处理24 h，恢复12 h，收集细胞，FCM法检测细胞凋亡，结果显示，Kif4A高表达后，多柔比星能上调MCF-7细胞凋亡，凋亡率为(9.23±0.70)%，与HA-pcDNA+多柔比星组［(7.19±0.75)%)和HAKif4A组［(6.80±0.23)%］相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；HA-Kif4A高表达也能诱导MCF-7细胞凋亡，凋亡率为(6.80±0.23)%，与HA-pcDNA组［(4.48±0.42)%］和对照组MCF-7组［(4.10±0.58)%］相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

Kif4A高表达后，多柔比星能上调MDAMB-231细胞凋亡，凋亡率为(11.40±0.63)%，与HA-pcDNA+多柔比星组［(7.10±0.61)%］和HA-Kif4A组［(8.36±0.79)%］相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；HA-Kif4A高表达也能诱导MDA-MB-231细胞凋亡，凋亡率为(8.36±0.79)%，与HA-pcDNA组［(4.44±0.36)%］和对照的MDA-MB-231组［(3.85±0.66)%］相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

本研究同时还比较在Kif4A高表达后MCF-7与MDA-MB-231细胞的凋亡差异，结果显示，HA-Kif4A、HA-Kif4A+3-ABA处理后，MDA-MB-231细胞凋亡率分别为(8.36±0.79)%和(11.40±0.63)%，与相对照的MCF-7细胞组相比，差异有统计学意义(P＜0.05，图5)。

图 5 FCM法检测Kif4A高表达对多柔比星诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响Fig.5 The apoptosis of MCF-7 and MDA-MB-231 cells after transfected with HA-Kif4A plasmid and treated with 1 μmol/L epirubicin were detected by FCM

3 讨 论

多柔比星作为一种常用的乳腺癌化疗药物，在乳腺癌的治疗中起着重要作用，然而由其引起的化疗耐药也越来越多［3］。研究表明P-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)［4］、乳腺癌耐药蛋白(breast cancerresistance protein，BCRP)、耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)［5］、乳腺癌易感基因BRCA1(breast cancer associated 1，BRCA1)［6］、PARP-1［7］在癌症化疗耐药中都起重要作用。Nelson等［8］研究前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌患者化疗干预后发现，在肿瘤附近的正常细胞(成纤维细胞)的DNA被化疗破坏时，也会向肿瘤微环境中释放一种称为WNT16B的蛋白，这种蛋白的高表达导致癌细胞生长、侵入附近组织并减弱了化疗药物在机体内的细胞毒性，促进肿瘤细胞存活、加速癌症病理过程。Daemen等［9］和Hiller等［10］研究结果显示，BRCA1突变的乳腺癌和(或)三阴性乳腺癌对PARP-1抑制剂治疗较多柔比星敏感，提示多柔比星处理后可能上调了PARP-1活性，增强了其损伤修复功能。Munoz-gamez等［2］在研究乳腺癌MDA-MB-231细胞时也发现，多柔比星处理后PARP-1活性能迅速上调，增强细胞损伤修复功能抑制MDA-MB-231细胞的凋亡。Midorikawa等［11］在研究大脑神经元发育中发现Kif4A可通过其羧基末端直接与PARP-1相结合，抑制PAPR-1的活性，介导神经元细胞的凋亡，提示Kif4A在调节PARP-1活性中起着重要作用。

Kif4A属于驱动蛋白(kinesin)超级家族，是以微管为轨道的分子马达(molecular motor)［12］。Kif4A蛋白含有N端保守的马达区(motor domain)、中间的卷曲螺旋颈区(neck region)和C端的尾区(tail domain)［13］。其马达区具有ATP酶活性，能通过水解ATP获得能量，改变构型，使Kif4A在以微管构成的轨道上进行滑行；而在Kif4A颈区，存在核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，使Kif4A能分布在细胞内和具有结合DNA的能力，这为Kif4A参与调节DNA损伤修复途径提供了可能；而Kif4A的尾区有一些分布规律的半胱氨酸，既可结合货物(cargo)，进行细胞内物资运输，又可结合相关蛋白，调节DNA损伤修复途径，参与细胞有丝分裂过程中染色体的固缩、仿垂体的形成及分离等［14-15］。

PARP-1是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的细胞核酶，其参与的聚ADP核糖化是真核细胞中蛋白质翻译后的重要修饰方式之一［16］。PARP-1的相对分子质量为113×103，其蛋白由6个结构域组成：其中Zn1、Zn2结构域中存在核定位信号(nuclear localization signal，NLS)和KRK-X(11)-KKKSKK序列，使其具有DNA结合能力，故Zn1、Zn2结构域也称为DNA结合结构域(DNA-binding domain，DBD)；而BRCT结构域与WGR结构域之间有一个富含赖氨酸和谷氨酸的高度保守的聚ADP核糖基化［poly(ADP-ribose)，PAR］结合位点，这为PARP-1催化结构域CAT介导PAR修饰提供了可能；Zn3是PARP-1中相对比较保守的结构域，其主要功能是与WGR结构域一同参与调节PAR修饰［17］。PARP-1可作为NF-kB和低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF1)的协同刺激因子调节基因转录，并且能与碱基切除修复因子(base excision repair，BER) 和X线修复交叉互补基因(X-ray repair cross-complementing，XRCC)结合，单链DNA损伤能诱导PARP-1、XRCC及固缩蛋白Ⅰ表达增加，上调PAR修饰，促进损伤DNA的修复［18-19］。

实验结果显示多柔比星作用后，乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的Kif4A蛋白低表达，PARP-1活性上调。高表达Kif4A后，MCF-7和MDA-MB-231细胞PARP-1活性明显被抑制，而多柔比星能部分逆转由外源性Kif4A高表达引起的PARP-1活性抑制。

多柔比星是通过何种机制诱导Kif4A低表达目前还不清楚，根据实验结果推测至少有两种可能情况：①多柔比星抑制乳腺癌细胞Kif4A蛋白表达；②多柔比星杀死乳腺癌细胞中Kif4A高表达的细胞，使Kif4A呈现出低的检测水平。此外多柔比星并不影响外源性Kif4A蛋白的表达，提示多柔比星对Kif4A的影响可能是在翻译水平(可能是对启动子的影响)。

多柔比星能诱导乳腺癌细胞后凋亡，PARP-1抑制剂抑制其活性后，细胞凋亡进一步增加。此外，MDA-MB-231细胞对PARP-1抑制剂3-ABA作用较MCF-7敏感，原因可能与MDA-MB-231细胞存在BRCA1突变(MCF-7细胞BRCA1野生型)有关。BRCA1作为乳腺癌中重要的一个损失修复蛋白，在同源重组修复发挥重要作用。已有报道证实Kif4A可通过BRCA1-BRCA2途径参与DNA损伤修复［15］，BRCA1的突变使该途径缺失，DNA损伤得不到有效修复，细胞凋亡增加。Kif4A的高表达抑制PARP-1的活性后，乳腺癌细胞凋亡，与MCF-7细胞相比，MDA-MB-231细胞凋亡明显；高表达Kif4A后，再用多柔比星处理细胞，细胞凋亡也进一步增加；原因也可能是Kif4A高表达后，PARP-1活性明显被抑制，由其介导的损伤修复途径失活，细胞凋亡增加，而多柔比星处理后，内源性Kif4A蛋白低表达，由其介导的另一条损伤修复途径Kif4A-BRCA1-BRCA1失活，使细胞进一步凋亡。然而PARP-1介导的损伤修复途径和BRCA1介导的损伤修复途径何者起主要作用有待进一步研究。

［1］ GANGADHARAN C, THOH M, MANNA S K. Inhibition of constitutive activity of nuclear transcription factor kappaB sensitizes doxorubicin-resistant cells to apoptosis［J］. J Cell Biochem, 2009, 107(2): 203-213.

［2］ MUNOZ-GAMEZ J A, MARTIN-OLIVA D, AGUILARQUESADA R, et al. PARP inhibition sensitizes p53-deficient breast cancer cells to doxorubicin-induced apoptosis［J］. Biochem J, 2005, 386(Pt 1): 119-125.

［3］ 王世清, 刘武红. 中、晚期乳腺癌术前表阿霉素介入治疗的临床观察［J］. 中国癌症杂志, 2000, 10(6): 574-574.

［4］ TSUJI K, WANG Y H, TAKANASHI M, et al. Overexpression of lung resistance-related protein and P-glycoprotein and response to induction chemotherapy in acute myelogenous leukemia［J］. Hematol Rep, 2012, 4(3): e18.

［5］ LAINEY E, SEBERT M, THEPOT S, et al. Erlotinib antagonizes ABC transporters in acute myeloid leukemia. Cell Cycle, 2012, 11(21): 4079-4092.

［6］ LE CALVEZ-KELM F, OLIVER J, DAMIOLA F, et al. RAD51 and breast cancer susceptibility: no evidence for rare variant association in the Breast Cancer Family Registry study［J］. PloS One, 2012, 7(12): e52374.

［7］ LEE KRAUS W, HOTTIGER M O. PARP-1 and gene regulation: Progress and puzzles［J］. Mol Aspects Med, 2013, 34(6): 1109-1123.

［8］ SUN Y, CAMPISI J, HIGANO C, et al. Treatment-induced damage to the tumor microenvironment promotes prostate cancer therapy resistance through WNT16B［J］. Nat Med, 2012, 18(9): 1359-1368.

［9］ DAEMEN A, WOLF D M, KORKOLA J E, et al. Crossplatform pathway-based analysis identifies markers of response to the PARP inhibitor olaparib［J］. Breast Cancer Res Treat, 2012, 135(2): 505-517.

［10］ HILLER D J, CHU Q D. Current Status of Poly(ADP-ribose) Polymerase Inhibitors as Novel Therapeutic Agents for Triple-Negative Breast Cancer［J］. Int J Breast Cancer, 2012, 2012: 829315.

［11］ MIDORIKAWA R, TAKEI Y, HIROKAWA N. KIF4 motor regulates activity-dependent neuronal survival by suppressing PARP-1 enzymatic activity［J］. Cell, 2006, 125(2): 371-383.

［12］ SAMEJIMA K, SAMEJIMA I, VAGNARELLI P, et al. Mitotic chromosomes are compacted laterally by KIF4 and condensin and axially by topoisomerase IIα［J］. J Cell Biol, 2012, 199(5): 755-770.

［13］ WU G, CHEN P L. Structural requirements of chromokinesin Kif4A for its proper function in mitosis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 372(3): 454-458.

［14］ HU C K, COUGHLIN M, FIELD C M, et al. KIF4 regulates midzone length during cytokinesis［J］. Curr Biol: CB, 2011, 21(10): 815-824.

［15］ WU G, ZHOU L, KHIDR L, et al. A novel role of the chromokinesin Kif4A in DNA damage response［J］. Cell Cycle, 2008, 7(13): 2013-2020.

［16］ HUAMBACHANO O, HERRERA F, RANCOURT A, et al. Double-stranded DNA binding domain of poly(ADP-ribose) polymerase-1 and molecular insight into the regulation of its activity［J］. J Biol Chem, 2011, 286(9): 7149-7160.

［17］ LANGELIER M F, PLANCK J L, ROY S, et al. Crystal structures of poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) zinc fingers bound to DNA: structural and functional insights into DNA-dependent PARP-1 activity［J］. J Biol Chem, 2011, 286(12): 10690-10701.

［18］ ELSER M, BORSIG L, HASSA P O, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase 1 promotes tumor cell survival by coactivating hypoxia-inducible factor-1-dependent gene expression［J］. Mol Cancer Res, 2008, 6(2): 282-290.

［19］ KONG X, STEPHENS J, BALL A R Jr, et al. Condensin I recruitment to base damage-enriched DNA lesions is modulated by PARP1［J］. PloS One, 2011, 6(8): e23548.

Epirubicin up-regulates PARP-1 activity dependent on Kif4A low expression in breast cancer cells

WANG Hui, LU Chang-qing, TIAN Bo, LI Qing, CHEN Tong-bing (Department of Pathology, the Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou Jiangsu 213003, China)

LU Chang-qing E-mail: 344575914@qq.com

Background and purpose: Chemotherapy is the important way of breast cancer treatment, but the drug-resistance has attracted special attention. The emergence of drug resistance is closely related to the abnormal enhancement of DNA-damage repair. Both Kif4A and PARP-1 are important molecules of DNA repair. The research investigated the function of Kif4A in epirubicin up-regulating the activity of PARP-1 in breast cancer cells and possible significance. Methods: Western blot was used to detect the expression of Kif4A and PARP-1 after treatment with epirubicin in MDA-MB-231 and MCF-7 cells; the expression of PARP-1 and its activity were detected after high expression of Kif4A and treatment with epirubicin; FCM was used to detect cell apoptosis after treatment with epirubicin combined with PARP-1 inhibitor 3-ABA. Results: Epirubicin up-regulated PARP-1 activity and induced low expression of Kif4A in breast cancer cells, both of them showed dose-dependent and time-dependent. After high expression of Kif4A, the activity of PARP-1 was inhibited and the apoptosis of cells increased, epirubicin partially reversed the activity of PARP-1 inhibited by high Kif4A expression. Both of epirubicin and 3-ABA induced cell apoptosis, combination of them further increased cell apoptosis compared with alone used (P＜0.05). The results also showed the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells induced by epirubicin, PARP-1 inhibitor 3-ABA and high expressionKif4A was higher than that of MCF-7 cells (P＜0.05). Conclusion: Epirubicin increases the activity of PARP-1 dependent on the low expression of Kif4A in breast cancer cells. Kif4A might become a novel target for overcoming resistance of epirubicin.

Kif4A; PARP-1; Epirubicin; MCF-7 cell; MDA-MB-231 cell

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.10.005

R737.9

：A

：1007-3639(2013)10-0804-09

2013-08-05

2013-09-30）

鲁常青 E-mail:344575914@qq.com