支气管肺泡灌洗液TB-DNA测定与其它TB检测方法比较研究

刘立宾 叶华丽 胡建成 何月龙 范大鹏

浙江省中西医结合医院结核实验室 杭州 310003

·实验研究·

支气管肺泡灌洗液TB-DNA测定与其它TB检测方法比较研究

刘立宾 叶华丽 胡建成 何月龙 范大鹏

浙江省中西医结合医院结核实验室 杭州 310003

目的：探讨支气管灌洗液涂片染色、支气管灌洗液培养及痰培养三种方法中结核杆菌阳性率与支气管灌洗液结核杆菌DNA拷贝数的关系。方法：对199例确诊肺结核患者分别应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术检测支气管灌洗液（BALF）结核分枝杆菌DNA（TB-DNA），并按TB-DNA拷贝数分为A（1×103～）、B（1×105～）、C（≥1×107）三组，并对所有患者行灌洗液涂片染色、灌洗液培养及痰培养结核杆菌。结果：灌洗液涂片染色法A、B、C三组阳性率分别为12.0%、60.2%、92.7%，三组间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05），三组间两两比较差异有统计学意义（P均＜0.05），且阳性率C组＞B组＞A组；灌洗液培养法A、B、C三组阳性率分别为18.7%、56.6%、87.8%，三组间差异有统计学意义（P＜0.05），两两比较差异有统计学意义（P均＜0.05），阳性率C组＞B组＞A组；痰培养法A、B、C三组阳性率分别为26.7%、65.1%、82.9%，三组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），两两比较差异有统计学意义，A组与B组、A组与C组比较P均＜0.05，B组与C组比较P＜0.05。结论：支气管灌洗液涂片染色、灌洗液培养、痰培养结核杆菌阳性率均随支气管灌洗液中结核杆菌DNA拷贝数递增而增高。。

支气管肺泡灌洗液 结核杆菌 荧光定量PCR

肺结核为全球流行性感染性疾病之一[1]，结核病的病原学检查是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据一[2]。涂片法简单、快速、经济，但灵敏性差，检出率低。结核杆菌培养仍是目前诊断肺结核的金标准，尤其是进一步可行菌型鉴定和药敏实验，并可鉴定死菌与活菌，被誉为结核病诊断的黄金标准，结核杆菌培养法虽特异性高，但所需时间较长[3]。荧光定量PCR（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）是近年用于临床病原菌检测的一种具有高灵敏性、高准确性、高特异性且定量范围宽、操作简便、快速安全、污染最少的可靠的DNA体外扩增技术[4]。FQ-PCR法检测支气管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中结核杆菌DNA（tuberculosis-DNA，TB-DNA）已成为快速诊断结核杆菌感染的一种非常有前途的方法，并被广泛应用到临床[5]。我们应用FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA，并与涂片法、培养法阳性率进行比较，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年5月—2011年12月本院住院确诊肺结核患者199例，年龄18～80岁，男102例，女97例。所有患者行电子支气管镜下集取支气管肺泡灌洗液，并用FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA，BALF涂片找抗酸杆菌，BALF培养及痰培养。同时将研究对象按FQ-PCR检测TB-DNA拷贝数分成A组（1×103～）75例、B组（1×105～）83例、C组（≥1×107）41例。

1.2 处理方法

1.2.1 灌洗液涂片染色法 纤支镜检查时于镜下见异常者或于X线胸片∕CT异常的相应叶段内行支气管肺泡灌洗，收集BALF 5mL，常规处理后，在生物安全柜中涂片，待干后经抗酸染色，以连续观察不少于300个不同视野未发现抗酸杆菌为阴性，其余为阳性。

1.2.2 结核杆菌培养法 所有患者标本按《结核病诊断细菌学检查规程》进行结核菌培养。从改良罗氏培养基上取单个菌落，参照《结核病诊断细菌学检查规程》的方法进行结核杆菌鉴定。

1.2.3 FQ-PCR法 收集BALF 5mL，行FQ-PCR检测。标本中加入2倍体积的4%NaOH，摇匀，室温下放置30min液化，液化过程中振荡2～3次，取1mL标本加入离心管中，12 000rpm离心5min，弃上清液留沉淀，加无菌生理盐水1mL洗涤，10 000rpm离心5min，再重复洗涤1次，标本加DNA提取液，于100℃15min裂解，15 000rpm离心10min。配制好PCR混合液（引物，荧光探针，MgCl2，Taq酶），将DNA模板加入PCR混合液，设阳性对照（1×104，1×106，1× 108），阴性对照。放入PCR扩增仪，设定程序，扩增。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件包分析数据，应用卡方检验。

2 结 果

2.1 灌洗液涂片阳性率 FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中，A、B、C三组灌洗液涂片阳性率分别为12.0%、60.2%、92.7%，三组间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。三组间两两比较P均＜0.05，且阳性率C组＞B组＞A组。灌洗液涂片阳性率随支气管灌洗液FQ-PCR拷贝数的递增而增高，见表1。

表1 各PCR组灌洗液涂片阳性率比较 例

2.2 灌洗液培养阳性率 FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中，A、B、C三组灌洗液培养阳性率分别为18.7%、56.6%、87.8%，三组间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。三组间两两比较，P均＜0.05，且阳性率C组＞B组＞A组。灌洗液培养阳性率随支气管灌洗液FQ-PCR拷贝数的递增而增高，见表2。

表2 各PCR组灌洗液培养阳性率比较 例

2.3 痰培养阳性率 FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中，A、B、C三组痰培养阳性率分别为26.7%、65.1%、82.9%，三组间阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。三组间两两比较，A组与B组、A组与C组P均＜0.05，B组与C组P＜0.05。痰培养阳性率随支气管灌洗液FQ-PCR拷贝数的递增而增高，见表3。

表3 各PCR组痰培养阳性率比较

3 讨论

FQ-PCR系统是一密闭的DNA扩增检测系统，在将扩增体系所需各物质加样完毕后，即可进行扩增和检测，扩增产物的检测是通过系统对荧光探针5c端游离的R基团荧光强弱的分析来判断扩增产物的量，当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。PCR反应每复制1个特异核苷酸片段，就有1个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少[6]。由于肺泡灌洗液进入远端气道及肺泡腔中接触病灶范围广，收集量大，含菌量多，标本充分离心沉淀。同时，灌洗刺激患者咳嗽，更有利于局部支气管分泌物的引流[7]。故本研究选取支气管灌洗液检测结核分枝杆菌DNA。

已有资料[8]表明，定量PCR与病原菌数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。本研究显示，FQ-PCR检测BALF中，C组（≥1×107）灌洗液涂片染色、灌洗液培养、痰培养结核杆菌阳性率明显高于A组（1×103～）和B组（1× 105～）。因此我们认为，临床上分析FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液TB-DNA拷贝数可以评估其它三种方法的阳性率。FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中拷贝数明显增高时，涂片染色、灌洗液培养、痰培养的阳性率明显增高，我们推测，此时检测到的结核杆菌可能为活菌，细菌正处于繁殖期，或者患者可能正处于一个感染活动期。结核杆菌培养是实验室检测结核杆菌的“金标准”，FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中拷贝数越高，结核杆菌培养阳性率也就越高，荧光定量PCR法随着拷贝数的增高而无限接近这个“金标准”。反之，FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液中拷贝数值偏低时，涂片染色、灌洗液培养、痰培养的阳性率相应地明显降低，此时检测到的细菌多为死菌，或结核杆菌正处于静止期、休眠期[9]，而患者正处于潜伏感染期、轻度感染期。

综上所述，对FQ-PCR检测支气管肺泡灌洗液TB-DNA拷贝数的分析可反映病原菌数量与感染性疾病病情的轻重程度，反映结核杆菌的繁殖情况，对鉴定死菌活菌也有一定的意义。FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA拷贝数，对抗结核药物的使用的指导意义尚需进一步探讨。

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［2］Kubista M，Andrade JM，Bengtsson M，et al.The real-time polymerase chain reaction［J］.Mol Aspects Med，2006，27（2-3）：95-125．

［3］Poole K.Efflux-mediated antimicrobial resistance［J］.J Antimicmb Chemother，2005，56（1）：20-51．

［4］李海东，刘国祥.荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中Tb-DNA诊断肺结核的临床价值［J］.西南军医，2005，7（6）:10-11.

［5］Cafforio P，Dammacco F，Gernone A，et al.Statins activate the mitochondrial pathway of apoptosis in human lymphoblasts and myelom cells［J］.Carcinogenesis，2005，26（5）：883-891．

［6］彭德虎，林云，石琳.荧光定量聚合酶链反应技术检测结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA［J］.临床肺科杂志，2006，11（4）:541.

［7］支气管肺泡灌洗液的结核分枝杆菌快速培养对疑似肺结核的诊断价值［J］.中国临床医学，2010，17（1）:35-36

［8］邵俊斌，王占坤，陈智，等.实时荧光定量聚合酶链反应法检测痰结核杆菌DNA及其临床应用［J］.中华结核和呼吸杂志，2003，26（8）:490.

［9］张红漫，李志惠，赵杰，等.荧光定量PCR测定支气管肺泡灌洗液中T bDNA对涂阴肺结核的诊断价值［J］.中国防痨杂志，2009，31（4）：227-229.

Relationship Between fluorescent quantitative-PCR Detecting Bronchoalveolar Lavage Fluid Tuberculosis DNA and other Tuberculosis detecting methods

LIU Libin, YE Huali, HU Jiancheng, et al. Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou (310003), China

Objective：To investigate the relationship between the copy number of tuberculosis-DNA(TB-DNA）in bronchoalveolar lavage fluid(BALF）by fluorescent quantitative PCR(FQ-PCR)and the positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training.Methods:TB-DNA in BALF from 199 definite tuberculosis patients was determined by FQ-PCR and then all samples were random ly divided into group A(1×103～）,group B（1×105～）,and group C（≥1×107）.All samples were treated with TB BALF smearing,TB BALF training,and TB sputum training.Results:In TB BALF smearing,the positive rate was significantly different in group A,B and C (12.0%,60.2%and 92.7%,respectively,P＜0.05）,with the highest in group C and the lowest in group A.The positive rate was significantly different in group A,B and C in TB BALF training(18.7%,56.6%and 87.8%,respectively,P＜0.05)and among them the difference was significant,with the highest in group C and the lowest in group A.The same result was found in TB spurum training(positive rates of group A,B and C were 26.7%, 65.1%and 82.9%,respectively).Conclusion:The positive rates of BALF smearing,BALF training,and sputum training increased with the rise of TB-DNA copy number in BALF.

tuberculosis bronchoalveolar lavage fluid fluorescent quantitative PCR

2012-09-26