林蛙卵油通过影响Bcl-2蛋白质家族抑制卵巢凋亡的机制

高 锐 苑春莉 孙连坤 王 玲 康劲松

(吉林大学第一医院妇产科，吉林 长春 130021)

中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)是两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属动物，其干燥输卵管称为林蛙油，是一种名贵食疗性中药。近年来的研究显示由提取林蛙油剩余的卵以及由卵提取的林蛙卵精油的保健价值更高〔1，2〕。本研究旨在分析林蛙卵油对于大鼠卵巢凋亡指数和Bcl-2和Bax表达的影响，分析林蛙卵油对卵巢细胞凋亡的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 雄激素处理模型制作及分组 选择9日龄Wistar清洁雌性大鼠50只，其中模型组40只，丙酸睾丸酮(25 mg/ml)1.25 mg/只皮下注射，建立丙酸睾丸酮诱导的卵巢损伤大鼠模型;正常对照组10只，同期生理盐水皮下注射〔3，4〕。分为高剂量(1.0 g/d)组、中剂量(0.4 g/d)组、低剂量(0.1 g/d)组，模型组和正常对照组，每组10只，各组在造模成功后喂养110 d至成年。模型组和正常对照组用生理盐水3 ml/d灌胃;林蛙卵油各剂量组应用林蛙卵油灌胃，用生理盐水稀释至3 ml，灌胃15 d后处死大鼠。采出右侧卵巢放入甲醛溶液固定，左侧卵巢立即放入 －70℃冰箱中速冻〔3，4〕。

1.2 Tunnel检测 Tunnel试剂盒购自Sigma公司，DAB显色试剂盒购自Sigma公司。用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(S-P法)染色。

1.3 Western印迹法检测 按照常规方法进行，蛋白提取、配制分离胶和浓缩胶、加样、电泳、切胶、转膜、封闭、加入一抗、加入二抗、显色、记录。

1.4 结果制定 Tunnel染色阳性为细胞核出现棕黄色颗粒。凋亡指数(AI)计算方法:随机选择10个凋亡肿瘤细胞数占所有肿瘤细胞数的百分比(细胞凋亡%=凋亡的细胞数/细胞总数 ×100%)。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 Tunnel免疫组织化学染色结果 模型组的凋亡指数(43% ±1.97%)较正常对照组(22% ±0.92%)升高，给予林蛙卵油后，凋亡指数降低。正常对照组与模型组有显著差异(P＜0.05)，中剂量组(30% ±0.74%)和高剂量组(31% ±0.96%)与模型组有显著差异(P＜0.05)，低剂量组(39% ±1.12%)与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 Western印迹结果 随着药物剂量增加，Bax表达降低，Bcl-2表达增加。与模型组比较，中剂量组和高剂量组的灰度值变化有显著差异(P＜0.05)。见图1和表1。

表1 各组大鼠Bcl-2、Bax的灰度值比(n=10)

3 讨论

林蛙卵中含有多种微量元素、维生素、不饱和脂肪酸、磷脂、氨基酸，富含雌二醇、孕酮〔1，2〕。林蛙卵油具有温和的降低血脂，软化血管，抑制血小板聚集、改善血液流变学特征、抑制血脂沉积作用〔5〕;有一定的中枢抑制作用〔6〕，有明显的增强机体抗脂质过氧化损伤，调节免疫的抗衰老的生物作用〔7〕，而且没有明显毒副反应。

细胞凋亡是细胞的一种具有形态学变化而不同于细胞坏死的死亡方法，凋亡在卵巢退化中发挥作用，存活前和凋亡前因子在卵巢凋亡过程中发挥作用，其间的精细调节对于卵巢的最终命运发挥了决定性作用:卵泡闭锁过程主要有Bcl-2家族成员、肿瘤坏死因子(TNF)和Caspases参与;排卵有Bcl-2，Bax，卵泡刺激素(FSH)，抑制素(inhibin)，Fas配体，caspases等参与〔8〕。我们制造的雄激素大鼠模型在形态学和部分内分泌学特性上符合多囊卵巢综合征的特点，其形态学特征表现为卵泡闭锁和持续不排卵〔3，4〕。本文结果说明雄激素可以促进卵巢凋亡，给予林蛙卵油灌胃后降低卵巢细胞的凋亡的发生，起到保护卵巢的作用。该保护作用有一定的剂量依赖性，需要林蛙卵油浓度达到一定程度。

B细胞淋巴瘤-2蛋白质家族包括存活前因子(Bcl-2，Mcl-1和Bcl-XL等)和凋亡前因子(Bax，Bcl-2相关X蛋白等)。Bcl-2是一种存活前因子，它定位于核膜和线粒体，它通过调节线粒体释放细胞色素C和Apaf-1和caspases-9的相互作用，与Bax结合，阻止由c-Myc引起的凋亡发挥抑制凋亡功能。Bax是凋亡前因子，定位于细胞质或细胞膜，对抗Bcl-2的防护作用。Bcl-2主要在发育卵泡中表达，Bax主要在闭锁卵泡中表达〔9，10〕。

本实验证实给予雄激素均使得卵巢前存活因子Bcl-2表达降低，而前凋亡因子Bax表达增加，提示雄激素增强了卵巢细胞的凋亡。给予林蛙卵油灌胃后，前存活因子Bcl-2表达有升高趋势，而前凋亡因子Bax表达有降低趋势，差异均有显著性，提示林蛙卵油可以通过影响Bcl-2蛋白质家族抑制卵巢细胞的凋亡，发挥保护卵巢的作用。

1 苑春莉，孙连坤，康劲松.林蛙卵油灌胃对于雄激素预处理大鼠妇科内分泌的影响〔J〕.中国实验诊断学，2010;14(2):196-8.

2 苑春莉，盛 辉，孙连坤，等.林蛙卵油灌胃对于雄激素预处理大鼠卵巢凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(17):2451-2.

3 王 宇，尚德静，冯伯森.中国林蛙蛙卵营养成分分析〔J〕.辽宁师范大学学报(自然科学版)，2004;27(4):471-3.

4 杜景新，王 丽，李春慧，等.林蛙油、林蛙卵油的成分及开发利用〔J〕.人参研究，2003;3(5):18-9.

5 彭 飞，徐 峰，刘 彬，等 中国林蛙卵油对高脂血症大鼠降脂作用的观察，医学理论与实践，2003;16(9):996-7.

6 彭 飞，韦媛媛，佟 岩，等.中国林蛙卵油抗的士宁惊厥的机制〔J〕.沈阳药科大学学报，2005;22(5):386-9.

7 彭 飞，徐 峰，赵 倩，等.中国林蛙卵油的抗惊厥作用及其与单胺神经递质的关系〔J〕.中国药学杂志，2005;40(12):912-5.

8 Matsuda F，Inoue N，Manabe N，et al.Follicular growth and atresia in mammalian ovaries:regulation by survival and death of granulosa cells〔J〕.JReprod Dev，2012;58(1):44-50.

9 Abir R，Orvieto R，Dicker D，et al.Preliminary studies on apoptosis in human fetal ovaries〔J〕.Fertil Steril，2002;(78):259-64.

10 Hsu SY，Hsueh AJ.Tissue-specific Bcl-2 protein partners in apoptosis:An ovarian paradigm〔J〕.Physiol Rev，2000;80(2):593-614.