不同神经移植体移植修复自体周围神经缺损时的再生效果比较＊!

黄启顺， 甘 萌， 郑怀远， 周学武， 周 攀， 陈振兵

华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科，武汉 430022

目前，对于周围神经损伤后缺损的修复，除了改变神经走行方向、屈曲其所跨过的关节以弥补较短的神经缺损外，大部分还需要用移植的办法进行解决。神经移植方法甚多，有自体、异体、异种神经移植，非神经组织移植和人工神经移植等［1－2］。在这些方法之中，无张力的自体神经移植仍然是神经缺损修复最主要的方法，其余的都存在着或多或少的、这样或那样的问题。周围神经缺损是一种混合神经缺损，采

用自体神经移植修复时常用腓肠神经或桡神经浅支，而这二者均为感觉神经，在结构及超微结构上与运动神经纤维有所区别。临床中也发现，用废弃的混合神经移植修复神经缺损，术后神经恢复效果比用单纯感觉神经移植修复的效果好，其中神经移植体结构可能是影响再生效果的一个重要方面。为此，我们建立了大鼠坐骨神经缺损模型，并采用自体不同类型神经移植体修复，以研究不同类型神经移植体的结构差异对混合神经缺损修复后再生效果的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

清洁级3周龄SD大鼠45只（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，编号：13314），随机分为3组，每组15只。将右侧坐骨神经自梨状肌下缘0.5cm处切断，并将远端切除0.5cm，制成神经缺损模型。运动神经移植组：取左侧后肢的股神经运动支约1.5cm长，重叠3股，移植修复；感觉神经移植组：取左侧后肢的腓肠神经桥接1.5cm，重叠3股，移植修复；混合神经移植组：取左侧后肢同部位坐骨神经0.5cm移植修复。见图1。术后动物分笼饲养。

1.2 神经再生长度检测

于术后2、4、8周分别从各组中随机抽取5只动物，1%戊巴比妥（50mg／kg）腹腔内注射麻醉，暴露出右侧坐骨神经移植修复段，观察神经大体生长情况。用显微外科镊以1mm的间隔由远而近夹捏神经，标记出最早出现腓肠肌收缩反应的部位，测量此点与近端吻合口之间的距离，此即运动神经最大的再生长度，以此作为神经再生速度的观察指标［3］。

图1 坐骨神经缺损的神经移植修复手术Fig.1 Nerve transplantation for the repair of sciatic nerve defect

1.3 肌肉湿重检测

于术后2、4、8周将各组进行神经再生长度检测后的动物处死，将腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节止点完整取下，用测量仪准确称取肌肉湿重。

1.4 组织形态学测定

术后第8周，神经再生长度测定后将动物处死，取胫神经远侧吻合口远端3mm神经组织，将取得的神经样本用2.5% 戊二醛溶液前固定，饿酸固定液后固定，梯度浓度乙醇脱水，环氧树脂618包埋，切片厚度为1μm，甲苯胺蓝染色，在光学显微镜下观察再生神经纤维总数和华勒氏变性的程度。制备超薄切片，枸橼酸铅及醋酸双氧铀染色，电镜下测量神经纤维的直径及髓鞘的厚度。

所有镜下组织图像采用形态测定软件（Leco Inst-ruments，St.Joseph，MI）进行分 析。在 放 大1 000倍镜下，每根神经随机选择4个区域进行分析，镜下计数神经纤维的数目并测出神经束的横截面积，神经纤维的总数／神经束面积即为神经纤维密度（根／单位面积）。

1.5 统计学分析

实验所得数据用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 12.0统计软件对数据进行分析，组间计量资料比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经再生长度

术后2周，各实验组神经再生长度差异无统计学意义。术后4、8周，运动神经移植组及混合神经移植组神经再生长度差异无统计学意义，但均大于感觉神经移植组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.2 肌肉湿重

术后2、4周时3组间腓肠肌湿重差异无统计学意义。术后8周时，运动神经移植组及混合神经移植组间腓肠肌湿重差异无统计学意义，但均大于感觉神经移植组，差异有统计学意义（均P＜0.05），见表2。与同时间点感觉神经移植组比较，＊P＜0.05

表1 各组神经再生长度比较（mm，±s，n＝5）Table 1 Comparison of the length of the regenerated nerve among the three groups（mm，±s，n＝5）

表1 各组神经再生长度比较（mm，±s，n＝5）Table 1 Comparison of the length of the regenerated nerve among the three groups（mm，±s，n＝5）

组别 术后时间2周 4周 8周感觉神经移植组4.0±0.4 9.1±2.2 15.8±1.2运动神经移植组 4.5±0.4 10.5±1.8＊ 19.1±1.4＊混合神经移植组 4.3±0.2 10.4±2.1＊ 20.6±1.5＊

表2 各组腓肠肌湿重的比较（g，±s，n＝5）Table 2 Comparison of the wet weight of the gastrocnemius muscle among the three groups（g，±s，n＝5）

表2 各组腓肠肌湿重的比较（g，±s，n＝5）Table 2 Comparison of the wet weight of the gastrocnemius muscle among the three groups（g，±s，n＝5）

与同时间点感觉神经移植组比较，＊P＜0.05

组别 术后时间2周 4周 8周感觉神经移植组2.63±0.21 2.12±0.17 1.32±0.14运动神经移植组 2.71±0.18 2.47±0.16 1.92±0.13＊混合神经移植组 2.69±0.17 2.51±0.15 2.03±0.11＊

2.3 再生神经纤维形态学观察

术后8周，染色后光镜下运动神经移植组和混合神经移植组可见大量成熟的再生神经纤维，束膜结构清晰，轴突排列整齐、规则；感觉神经组只能见到少量再生神经纤维，未形成束膜结构，轴突走行仍不规则（图2）。

在电子显微镜下，运动神经移植组和混合神经移植组可以见到大量的神经纤维再生以及成熟的神经纤维和髓鞘形成，并可以见到在华勒氏变性过程中清除神经碎片的巨噬细胞。感觉神经移植组可以同时见到有髓鞘和无髓鞘的神经纤维再生，但是神经纤维的数目和髓鞘的厚度则要小很多（图3）。

2.4 各组神经再生效果的比较

术后8周时，运动神经移植组与混合神经移植组的再生神经纤维总数、神经纤维的密度差异无统计学意义，但均大于感觉神经移植组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

图2 光镜下观察术后8周再生神经轴突（甲苯胺蓝染色，×400）Fig.2 The axon of the regenerated nerve under the light microscope at 8weeks post operation（toluidine blue staining，×400）

图3 电镜下观察术后8周再生神经髓鞘（×1 000）Fig.3 The myelin of the regenerated nerve under the electron microscope at 8weeks post operation（×1 000）

表3 各组术后8周神经纤维总数以及密度的比较（±s，n＝5）Table 3 Comparison of the total number and the density of the nerve fibers among different groups at 8weeks post operation（±s，n＝5）

表3 各组术后8周神经纤维总数以及密度的比较（±s，n＝5）Table 3 Comparison of the total number and the density of the nerve fibers among different groups at 8weeks post operation（±s，n＝5）

与感觉神经移植组比较，＊P＜0.05

组别 神经纤维总数（根）神经纤维密度（根／mm2）感觉神经移植组416.2±32.3 753.8±62.5运动神经移植组 1 183.5±67.3＊ 2 346.6±213.2＊混合神经移植组 1 082.2±64.4＊ 2 171.7±789.3＊

3 讨论

在人体正常的结构中，支配肌肉的运动神经纤维主要为α神经纤维，其直径约为17μm，而皮肤感觉神经纤维为α2类感觉神经纤维，它的直径约为5～15μm。混合神经再生过程中，其中的运动神经纤维和感觉神经需要选择合适的管道通过，当用相同神经纤维管径的运动神经桥接时，再生运动神经纤维能获得更合适的延伸空间；当用感觉神经桥接时，其纤维管道则明显小了很多了，再生的运动神经纤维需要强行通过这一瓶颈。从两者的微观物理结构来看，运动神经移植物与混合神经中的运动神经纤维管径更匹配。Robinson等［4］采用大鼠股神经Y管模型研究运动轴突趋化性再生的准确度，结果发现远端插入大小相似的运动和感觉神经时，再生的运动轴突早期均等地向两侧生长，但最终趋向于运动神经端；远端插入的感觉神经端较粗大时，再生的运动轴突则明显趋向于感觉神经端生长。这在本实验中也得到了体现。在光学显微镜下，运动神经移植组与混合神经移植组在神经纤维的总数、神经的密度上都明显优于感觉神经移植组。而且到术后第8周，在防止肌萎缩及恢复所支配肌肉功能方面，运动神经移植组和混合神经移植组也优于感觉神经移植组。形态学方面，感觉神经移植组镜下见到更多的是杂乱的细胞残片。在电子纤维镜下进一步观察，运动神经移植组可见到成熟粗壮的再生神经纤维，再生神经纤维直径以及髓鞘的厚度上要优于感觉神经移植组。这一系列的组织形态学测定表明，运动神经或混合神经移植组的物理微观结构更有利再生神经纤维的生长。

神经再生有趋化性在学术界得到了广泛的承认，其理论的基本观点为：神经在再生的过程中，新生的轴突受到远端神经或靶组织所释放的化学物质的诱导作用而定向生长。神经受损后神经远端在2～3d内会发生华勒氏变性，包括轴突及其髓鞘的清除和施万细胞的增殖。这些未分化的施万细胞在基底膜管内形成Blanger带，并产生多种神经趋化因子和营养因子，而这些因子能够引导及促进神经的再生。然而，施万细胞分泌的趋化及神经营养因子在感觉及运动神经的表达和分布有所不同。如L2／HNK-1主要由运动神经中的施万细胞分泌，在培养液中加入L2／HNK-1发现，其只影响运动神经元生长，而不影响感觉神经元［3，5］。当运动神经作为桥接物时，其含有的施万细胞所产生的L2／HNK-1能诱导再生神经纤维沿着基底膜支架向远端生长。而感觉神经移植物的施万细胞不能分泌L2／HNK-1，因而不具备这种诱导作用。并且Brenner等［5］的实验显示，感觉神经抑制物对神经的再生似乎还有抑制作用。实验中，用隐神经作为移植物桥接胫神经观察神经再生，当增加隐神经的股数时，再生的神经纤维总数、神经纤维的密度并没有随着增加，反而出现了相应的减少，而运动神经组则没有这种现象出现。作为移植物的感觉神经是否产生了某种物质或者有某种机制阻碍了神经纤维的再生，尚有待于进一步研究。

本研究显示，不同的神经移植材料对自体神经移植再生效果有着显著影响，且运动神经及混合神经移植修复自体周围神经缺损时的再生效果优于感觉神经移植，其原因与移植神经的微观物理结构和神经再生的趋化性有关。

［1］ Kemp S W，Walsh S K，Zochodne D W，et al.A novel method for establishing dailyinvivoconcentration gradients of soluble nerve growth factor （NGF）［J］.J Neurosci Methods，2007，165（1）：83-88.

［2］ 黄英如，蒋电明，欧云生，等 .雷公藤多甙对异体神经移植后免疫反应及骨骼肌萎缩的影响［J］.华中科技大学学报：医学版，2009，38（3）：329-334.

［3］ Martini R，Xin Y，Schmitz B，et al.The L2／HNK-1Carbohydrate epitope is involved in the preferential outgrowth of motor neurons on ventral roots and motor nerves［J］.Eur J Neurosci，1992，4（7）：628-639.

［4］ Robinson G A，Madison R D.Influence of terminal nerve branch size on motor neuron regeneration accuracy［J］.Exp Neurol，2009，215（2）：228-235.

［5］ Brenner M J，Hess J R，Myckatyn T M，et al.Repair of motor nerve gaps with sensory nerve inhibits regeneration in rats［J］.Laryngoscope，2006，116（9）：1685-1692.