牛玻璃酸酶酶学特性的研究

杨萌萌，韩 玲，*，李儒仁，余群力，左秀峰，韩广星，郭兆斌

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070；2.山东绿润食品有限公司，山东临沂276000）

牛玻璃酸酶（Hyaluronidase），是从牛睾丸中提取的一类水解酶，是我国生化制药行业的重要产品之一。牛玻璃酸酶能够水解透明质酸，用于人体能暂时降低细胞间质粘性，可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，是一种重要的药物扩散剂。临床用作药物渗透剂，促进药物吸收，促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。玻璃酸酶不但在医药领域有着广泛的应用，而且在保健品、食品添加剂领域也有卓越的贡献。人为补充玻璃酸酶保健品可消除皱纹或使局部器官增厚增高，使皮肤保持弹性。

目前，对玻璃酸酶的研究主要针对哺乳动物睾丸、蝎毒、蜂毒、蛇毒等，并且已经从牛睾丸[1]、虾胰腺[2]以及蝎毒[3-4]、蜂毒[5]、蛇毒[6-8]、鱼毒[9]、毛虫毒[10]中分离出了玻璃酸酶。但是，国内对于玻璃酸酶的研究主要是粗酶液的制备和粗酶液性质的研究，并且，针对同一原料，对其粗酶液的性质研究出现了不同的结果，由于粗酶液中存在大量杂蛋白，杂蛋白对酶的稳定性以及酶学性质的研究有很大影响。因此，实验以色谱层析纯化后的牛玻璃酸酶为原料，对牛玻璃酸酶酶学性质进行研究，为玻璃酸酶的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛睾丸 采自山东绿润食品有限公司，选取检疫合格的牛睾丸，清除表面异物，用聚乙烯塑料包装袋密封包装，液氮冻藏后于-80℃贮藏，备用；透明质酸钠、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、乙酸、乙酸钠、NaCl、硫酸铵、丙烯酰胺、N-N-甲叉双丙稀酰胺、甘氨酸、Tris、甘油、考马斯亮蓝、甲醇、冰醋酸 分析纯；SP Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100（GE）。

DS-1型组织捣碎机 金坛市金南仪器厂；PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；HH-2型恒温水浴锅 上海博迅实业公司医疗设备厂；AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器公司；SP-756P型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；DYY-6c型电泳仪电源、25D型电泳槽 北京市六一仪器厂；DPS-2型蛋白纯化系统 上海金达生化仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛玻璃酸酶粗酶液的提取 牛睾丸去外膜后，切成块状，加入提前预冷的提取剂（w/v=1∶2），匀浆3min，4℃冰箱中静置提取12h，离心（8000r/min，4℃，20min），弃去沉淀，得到牛玻璃酸酶提取液；在提取液中加入饱和硫酸铵溶液使硫酸铵的浓度达到35%，混匀静置4h，离心（8000r/min，4℃，20min），得上清液；上清液中加入饱和硫酸铵溶液使其浓度达到70%，混匀静置8h，离心（8000r/min，4℃，20min）得沉淀，在4℃蒸馏水中透析，透析后得到牛玻璃酸酶粗酶液[11]。

1.2.2 牛玻璃酸酶的纯化 将粗酶液加载到离子交换预装柱（SP Sepharose Fast Flow），平衡缓冲液为50mmol/L乙酸-乙酸钠（pH5.4），洗脱缓冲液为50mmol/L乙酸-乙酸钠（pH5.4，包含1mol/L NaCl），流速为5mL/min。收集有活性的部分用于凝胶过滤层析（Sephacryl S-100）纯化，平衡缓冲液与洗脱缓冲液为50mmol/L乙酸-乙酸钠（pH5.4，包含0.15mol/L NaCl），流速为0.5mL/min。收集有活性的部分用于SDS-PAGE和酶学性质的研究[12-14]。

1.2.3 牛玻璃酸酶酶活的测定 参照Mayumi[15]的方法并予以改进。0.2mL酶液与0.8mL透明质酸钠储备液，混合后37℃下保温15min，同时做空白实验。孵化结束后立即加入0.22mL四硼酸钾沸水浴4.5min，迅速冷却4min；加6mL稀释至10倍体积的DMAB显色剂，然后37℃保温20min，迅速冷却5min。显色反应结束后，10000r/min，4℃离心10min，585nm下测吸光度值。一个酶活单位（U）被定义为，在最适反应温度（37℃）条件下，玻璃酸酶分解透明质酸钠，每分钟释放1μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖的量。

1.2.4 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法[16]。

1.2.5 SDS-PAGE 经过色谱层析纯化的样品用于SDS-PAGE，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，Tris-glycine（pH8.8）作为电泳缓冲液，电泳结束后用考马斯亮蓝染色液染色1h。

1.2.6 牛玻璃酸酶酶学性质的研究

1.2.6.1 最适反应温度及热稳定性 在pH4.5的条件下，以透明质酸钠为底物，分别测定玻璃酸酶在4、15、24（室温）、37、45、50、55、60、70℃条件下的酶活力。此外，将玻璃酸酶在上述温度下分别预处理60min，观察其热稳定性[17]。

1.2.6.2 pH对牛玻璃酸酶活性的影响 用0.2mol/L乙酸钠溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L）。以透明质酸钠为底物，测定牛玻璃酸酶在2.5～7.5不同pH条件下的酶活。

1.2.6.3 NaCl浓度对牛玻璃酸酶活性的影响 用0.2mol/L乙酸钠溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L），其中NaCl浓度分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mol/L。用上述含不同NaCl浓度的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制底物透明质酸钠，测定酶活，考察NaCl浓度对酶活的影响。

1.2.6.4 BSA浓度对牛玻璃酸酶活性的影响 用0.2mol/L乙酸钠溶液和0.2mol/L乙酸溶液配成pH为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.1mol/L），其中BSA浓度 分别为 0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9、1.05mol/L。用上述含不同BSA浓度的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制底物透明质酸钠，测定酶活，观察BSA浓度对酶活的影响。

1.2.6.5 金属离子对牛玻璃酸酶活性的影响 玻璃酸酶中分别加入Fe3+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、K+，使各离子溶液在酶液中的终浓度为0.8mmol/L，室温下反应60min后检测酶活变化。空白不加任何离子，考察酶活变化情况[18]。

1.2.6.6 不同物质浓度对牛玻璃酸酶活性的影响 在0.1mol/L的乙酸乙酸钠缓冲液（pH4.5）中，玻璃酸酶分别与不同浓度的肝素、硫酸软骨素（A、B、C）、人类血清蛋白及半胱氨酸混合均匀，4℃下反应30min后测其酶活。反应条件一致的情况下，对照不加抑制剂和激活剂，观察酶活变化情况。

2 结果与讨论

2.1 SDS-PAGE

由图1可知，阳离子交换层析之后（IEX），杂蛋白较多；粗酶液经过阳离子交换层析和凝胶过滤（GF）层析两步纯化后，1号泳道出现两个浓度较高的条带，其分子量在55～72ku之间。这一结果与Malcolm Lyon[1]的研究结果一致，这两条带显示的酶属于同工酶，均属于糖蛋白。

图1 牛玻璃酸酶SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of hyaluronidase from bovine testicular

2.2 温度对牛玻璃酸酶活性的影响

由图2可知，在4～70℃范围内，牛玻璃酸酶的酶活随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势，37℃时达到最大值，这与Yang[19]的结果一致。60、70℃的酶活分别为最高酶活的14.84%和4.31%。不同温度下预处理1h之后，温度从4℃升高至37℃的过程中，酶活稳定；从37℃升高至60℃过程中，牛玻璃酸酶很不稳定，并且酶活损失严重，在60℃下酶活完全丧失。

图2 牛玻璃酸酶的最适温度和热稳定性Fig.2 Optimal temperature and thermal stability of hyaluronidase from bovine testicular

2.3 pH对牛玻璃酸酶活性的影响

酸性环境对牛玻璃酸酶维持活性是必不可少的条件，如图3所示，不同pH的0.1mol/L乙酸乙酸钠溶液对玻璃酸酶酶活的影响不同，呈现先上升后下降的趋势。高酸性抑制酶活，pH为2.5时，酶活趋近于零；碱性环境对酶起抑制作用；pH为4.5时，酶活最高。

图3 牛玻璃酸酶的最适pHFig.3 Optimal pH of hyaluronidase from bovine testicular

2.4 NaCl浓度对牛玻璃酸酶活性的影响

图4 NaCl浓度对牛玻璃酸酶活性的影响Fig.4 Effect of NaCl on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

由图4可知，不同浓度的NaCl对玻璃酸酶酶活的影响各不相同。以不添加NaCl的为基准，浓度在0.05～0.45mol/L的范围内提高酶活，超过0.45mol/L时抑制酶活，0.2mol/L时酶活最高，比不添加NaCl的高出了20U/mg。

2.5 BSA浓度对牛玻璃酸酶活性的影响

由图5可知，以不加BSA为基准，浓度在0～0.75mol/L的范围内增加酶活，0.45mol/L时酶活最高，增加了34%。当BSA浓度超过0.75mol/L时，BSA开始抑制酶活，1.05mol/L时损失了33%的酶活。

图5 BSA浓度对牛玻璃酸酶活性的影响Fig.5 Effect of BSA on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

2.6 金属离子对牛玻璃酸酶活性的影响

由图6可知，以不加金属离子为基准，七种离子对牛睾丸玻璃酸酶均有不同程度的抑制作用，酶活损失较多。其中Fe3+对该酶的抑制作用相对其他离子较强，Mg2+的抑制作用相对较弱。金属离子可以对玻璃酸酶产生抑制作用，可能是因为其阻碍了酶和底物的结合作用，从而抑制了该酶的酶活。

图6 金属离子对牛玻璃酸酶活性的影响Fig.6 Effect of metal ions on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

2.7 不同物质浓度对牛玻璃酸酶活性的影响

由图7可知，不同物质的浓度对玻璃酸酶酶活的影响各不相同。硫酸软骨素A的浓度为1.2mg/mL时，损失了31.08%的酶活，随着浓度的下降，酶活损失的就越少，当浓度为0.012mg/mL时，酶活基本上没有损失。不同浓度的硫酸软骨素B对酶活的影响不大，1.2、0.12mg/mL时分别损失了7.23%和5.07%，0.012mg/mL增加了1.36%的酶活。硫酸软骨素C对酶活的影响显著，1.2mg/mL时损失了45.07%的酶活，低浓度时酶活基本没有损失。肝素对酶活起着较小的抑制作用，损失在10%之内。低浓度的人类血清蛋白可增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶完全失活。

图7 不同物质浓度对牛玻璃酸酶活性的影响Fig.7 Effect of different material on the activity of hyaluronidase from bovine testicular

3 结论

3.1 牛玻璃酸酶水解透明质酸钠的最适pH和温度分别为4.5和37℃，在4～45℃条件下稳定性较好。NaCl和BSA浓度分别为0.2、0.45mol/L时酶活最高。

3.2 金属离子Mg2+对该酶的抑制作用较弱，Fe3+的抑制作用较强。硫酸软骨素A浓度为1.2mg/mL时对酶有抑制作用，低浓度0.012mg/mL时对酶基本没有影响。硫酸软骨素B对酶的抑制作用较小，浓度0.012mgm/L时可增加少许酶活。硫酸软骨素C浓度为1.2mg/mL时，对酶的抑制作用较强。肝素在浓度低时抑制作用较高。人类血清蛋白在低浓度时增加1.05%的酶活。半胱氨酸使酶失活。

[1]Malcolm Lyon，Charles F Phelps.A rapid purification of bovine testicular hyaluronidase by chromatography on dermatan sulphate-substituted 1，6-diaminohexane-Sepharose 4B[J].The Biochemical Society，1981，199：419-426.

[2]Ashok M Krishnapillai，K D Anthony Taylor，Anne E J Morris.Characterisation of Norway lobster（Nephrops norvegicus）hyaluronidase and comparison with sheep and bovine testicular hyaluronidase[J].Food Chemistry，1999，65：515-521.

[3]Andrea C Pessini，Tania T Takao，Elisangela C Cavalheiro，et al.A hyaluronidase from Tityus serrulatus scorpion venom：isolation，characterization and inhibition by flavonoids[J].Toxicon，2001，39：1495-1504.

[4]Luo Feng，Rong Gao，Ponnampalam Gopalakrishnakone.Isolation and characterization of a hyaluronidase from the venom of Chinese red scorpion Buthus martensi[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2008，148：250-257.

[5]Gmachl M，Kreil G.Bee venom hyaluronidase is homologous to a membrane protein of mammalian sperm[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA，1993，90：3569-3573.

[6]K S Girish，R Shashidharamurthy，S Nagaraju，et al.Isolation and characterization of hyaluronidase a“spreading factor”from Indian cobra（Naja naja） venom[J].Biochimie，2004，86：193-202.

[7]徐洵，王贤舜，席杏团，等.尖吻蝮（Agkitrodon aeutus）蛇毒的研究[J].生物化学与生物物理学报，1983，15（6）：577-582.

[8]Karla C F Bordon，Márcio G Perino，José R Giglio，et al.Isolation，Enzymatic Characterization and Action as Spreading Factor of a Hyaluronidase from Crotalus durissus terrificus Snake Venom[J].Toxicon，2012，60：197.

[9]Marta R Magalhaes，Nelson Jorge da Silva Jr，Cirano J Ulhoa.A hyaluronidase from Potamotrygon motoro（freshwater stingrays）venom：Isolation and characterization[J].Toxicon，2008，51：1060-1067.

[10]Ana Isabel da C B Gouveia，Rafael B da Silveira，Helena B Nader，etal.Identification and partialcharacterisation of hyaluronidases in Lonomia obliqua venom[J].Toxicon，2005，45：403-410.

[11]李丹，郭育涛，杨永利，等.牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研究[J].应用化工，2011，40（8）：1417-1429.

[12]Batista C V，Roman-Gonzalez S A，Salas-Castillo S P，et al.Proteomic analysis of the venom from the scorpion Tityus stigmurus：Biochemical and physiological comparison with other Tityus species[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2007，146：147-157.

[13]Morey S S，Kiran K M，Gadag J R.Purification and properties of hyaluronidase from Palamneus gravimanus（Indian black scorpion）venom[J].Toxicon，2006，47：188-195.

[14]Kudo K，Tu A T.Characterization of hyaluronidase isolated from Agkistrodon contortrix contortrix（Southern Copperhead）venom[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2001，386：154-162.

[15]Mayumi Ikegami-Kawai，Tomoko Takahashi.Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity[J].Analytical Biochemistry，2002，311：157-165.

[16]王学奎.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2006：190-192.

[17]王文婷，韩玲，田甲春，等.牦牛肉组织蛋白酶L酶学特性的研究[J].食品工业科技，2012，33（15）：141-144.

[18]Ikuko Kakizaki，Isoshi Nukatsuka，Keiichi Takagaki.Effects of divalent cations on bovine testicular hyaluronidase catalyzed transglycosylation of chondroitin sulfates[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，406：239-244.

[19]Yang C-H，Srivastava P N.Purification and properties of hyaluronidase from bull sperm[J].Journal of Biological Chemistry，1975，250（1）：79-83.