斑玉蕈菌株的IGS2序列和RAPD分析

潘 越，陈 辉，冯志勇，*，陈明杰，汪 虹，张津京

（1.南京农业大学生命科学学院，南京210095；2.国家食用菌工程技术研究中心，农业部南方食用菌资源利用重点开放实验室，上海市农业遗传育种重点开发实验室，上海市农业科学院食用菌研究所，上海201403）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus）又名真姬菇、蟹味菇、鸿喜菇等，隶属白蘑科玉蕈属，是重要的工厂化食用菌之一[1]。斑玉蕈味道鲜美，是一种珍稀食用菌品种，在国内外都受到食用菌生产行业的重视，其在日本、韩国和国内上海等地已经实现了工厂化生产模式，且效益良好。近年来，随着食用菌市场竞争的日趋激烈，假劣菌种充斥着市场，极大地影响了整个产业的健康发展。为保护我国食用菌物种的遗传资源，迫切需要简便、可靠的方法研究斑玉蕈菌株种质资源的遗传多样性。

在对真菌rDNA的研究中，通常认为IGS2序列是高变区，该序列变异性大，进化较快，可用于真菌种间和种内遗传多样性研究。Saito等[2]对16个香菇商业栽培菌株的IGS2序列进行过研究，表明香菇种内菌株间IGS2序列有着显著的差异。在国内，黄晨阳等[3]对8个刺芹侧耳菌株的IGS2序列进行研究，研究显示刺芹侧耳不同菌株的IGS2序列有丰富的多样性。

RAPD技术是1990年由Williams首先报道的一种分子标记技术[4]，如今已经成为生物种内变种和种群差异性研究的通用手段和标记。它具有操作简单、多态性高、DNA用量少、信息量大等优点。这一方法已经广泛应用于草菇[5]、松口蘑[6]、双孢蘑菇[7]、木耳[8]、杏鲍菇[9]等主要食用菌的菌种资源研究中。在斑玉蕈中，许占伍等[10]使用RAPD技术成功分析了斑玉蕈单核菌株的遗传多态性，为斑玉蕈育种材料的选择提供了一定的分子水平依据。

本文拟利用IGS2和RAPD分子标记技术，以20个不同的斑玉蕈菌株为实验材料，探讨各菌株间的亲缘关系，旨在为斑玉蕈菌株的快速准确鉴别提供技术依据，为斑玉蕈种质资源的知识产权保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验中斑玉蕈菌株共20份 具体来源见表1；感受态细胞 Tiangen公司；PCR试剂、pGEM-T载体TaKaRa公司；Axy Prep DNA试剂盒 爱思进生物技术有限公司；IGS2引物 由上海捷瑞生物工程有限公司合成；RAPD随机引物 由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 供试菌株Table 1 Tested strains of Hypsizygus marmoreus

5810R型高速冷冻离心机 Eppendorf；PCR扩增仪，Power PAC 3000水平电泳仪，VDS凝胶成像系统等。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 将低温保藏的斑玉蕈菌种活化后接种于PDA平板上，25℃暗室培养15～18d，收集菌丝。采用CTAB法[11]提取基因组DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，使用Nano Drop测定DNA浓度，将基因组DNA样品浓度稀释到50ng/μL，-20℃保存备用。

1.2.2 IGS2分析

1.2.2.1 IGS2片段的扩增 使用真菌通用引物5SRNAR/InvSR1R（表2）对供试菌株进行扩增。25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）0.5μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O补平至25μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃7min。4℃保存。

1.2.2.2 扩增片段的回收与克隆 PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，利用Axy Prep DNA试剂盒进行回收，按照PGEM-T Vector试剂盒说明书进行连接，转化于大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中，将菌液涂布于含氨苄青霉素的LB平板（含X-gal和IPTG），于37℃倒置培养12～16h，挑取阳性转化子送往上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.2.3 数据分析 对所得序列中计算机误读的个别碱基进行人工校对，校对后的DNA序列用NCBI BLAST进行序列搜索，确定为IGS2序列后，使用DNAStar软件进行序列相似度比对。

表2 IGS2引物Table 2 Primer of IGS2

1.2.3 RAPD分析

1.2.3.1 引物筛选 从随机引物中筛选出对所有20个菌株扩增效果较好、多态性高、稳定性较强的引物对样品进行扩增。

1.2.3.2 反应体系及参数 25μL反应体系：10×PCR buffer 2.5μL（含Mg2+20mmol/L），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，引物（10umol/L）0.5μL，模板DNA（50ng/L）2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，ddH2O补平至25μL。PCR反应程序为：94℃ 3min；94℃ 1min，38℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃ 7min。4℃保存。PCR产物电泳检测：PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色后，在VDS摄影系统下观察结果并拍照。

1.2.3.3 数据处理 根据片段的迁移率及有无（有带记为1，无带记为0），统计得到二元数据，转换为数字矩阵。使用NTSYSpc分析软件对数据进行处理，采用UPGMA法构建遗传相关聚类图谱。

2 结果与分析

2.1 20株斑玉蕈形态学特征

选取六株具有代表性的菌株，其子实体形态图见图1。20株斑玉蕈的形态学特征见表3。

图1 部分菌株的子实体形态图Fig.1 The morphology picture of part strains

2.2 IGS2分析

2.2.1 IGS2-PCR 对20个供试菌株的扩增结果显示，所有菌株均可扩增出目的片段，不同菌株间IGS2序列大小没有显著差异，均在1200bp左右（图2）。

2.2.2 IGS2-测序 测序结果表明，不同斑玉蕈菌株的IGS2序列大小存在差异，在1150～1203bp之间，将所有菌株的序列提交到GenBank，登录号见表4。使用DNAStar对序列进行比对和分析并计算序列相似性系数。20个斑玉蕈菌株的IGS2片段总的变异位点数为139个，占总碱基数的11.6%。序列间相似性系数约在95%以上（表5），除了19号菌株与20号菌株序列完全一致以外，其他菌株序列均存在差异。

表3 20株斑玉蕈形态学特征Table 3 Morphology character of 20 Hypsizygus marmoreus

图2 20个斑玉蕈菌株的IGS2扩增电泳图Fig.2 IGS2-PCR profile of 20 tested strains

表4 斑玉蕈菌株IGS2序列的登录号Table 4 GenBank accession numbers of IGS2 sequences of 20 strains

表5 20个斑玉蕈菌株IGS2序列相似度Table 5 Table of similarity between sequence

2.3 RAPD分析

2.3.1 RAPD扩增图谱分析 从供试的100个随机引物中筛选出条带清晰稳定、多态性高、重复性好的11个引物（表6）。11个引物共扩增出142条清晰可用的DNA条带，其中特异性条带134条，多态性94.4%。不同引物扩增出的DNA片段数不尽相同，在8～21条之间，其分子量绝大多数在0.5～4ku之间，不同菌株的DNA指纹图谱均包含丰富的多态信息（图3）。

表6 RAPD-PCR扩增反应的随机引物Table 6 Primers of RAPD-PCR

图3 部分引物对20个斑玉蕈菌株的扩增结果Fig.3 DNA fragments amplified by part random primers

2.3.2 RAPD聚类分析 根据所得图谱资料，综合11个引物对20个菌株的DNA扩增结果，构建遗传距离矩阵。应用NTSYSpc分析软件计算菌株间的相似性系数，用UPGMA法进行聚类分析，生成供试菌株的亲缘关系树状图（图4）。

图4 RAPD聚类分析图Fig.4 Dendrogram of 20 strains based on RAPD cluster analysis

根据图3显示的结果，20个斑玉蕈菌株的相似系数主要在0.57～0.92之间。在大约0.68的相似性水平上，所有的菌株可以分为5个组，第一组以0.77水平值又分成A、B两个亚组。A组共6个菌株，分别为1、2、4、7、10、11号菌株，B组共5个菌株，分别为3、6、8、15、16号菌株。13和17号菌株归为第二组，9和1号菌株归为第三组，14、18、19、20号菌株归为第四组，其中白色突变菌株（19号）与原野生型菌株（20号）聚为一类，两个白色野生型菌株（14号和18号）聚为一类。5号菌株与其他所有菌株分开，单独列为一组。

3 结论与讨论

本研究首先对20个供试菌株进行了IGS2序列测序分析，虽然有研究报道IGS2序列为低保守基因区域，在种内不同菌株间存在明显差异。但本研究对斑玉蕈不同菌株的测序结果显示，斑玉蕈的不同菌株间IGS2序列差异不明显，仅存在个别碱基的差异，大部分菌株的IGS2序列相似度在95%以上，在IGS2片段的琼脂糖凝胶电泳图上也不能将不同菌株区分开来，这与香菇[2]、刺芹侧耳[3]、双色蜡蘑[12]等食用菌IGS2序列的研究结果不一致。在其他部分真菌的IGS研究中，也观察到与本研究类似的现象，即一个菌株的IGS2序列仅为单一条带，不存在大小有显著差异的多态性条带。如梁宏等[13]对腥黑粉菌11个菌株的IGS2区域进行了研究，研究结果表明各菌株的IGS2区域均为单一条带，IGS2片段的保守性较强，没有显著的差异。在食用菌中，李黎等[14]在研究木耳不同菌株的IGS2序列时发现，木耳不同菌株的IGS2序列相似度很高，仅存在少数碱基的差异。因此，不同真菌的IGS2序列存在着明显的差异，还有待进一步的深入研究。

RAPD是一种能快速、简便且准确地检测基因组DNA多态性的分子标记，本研究通过优化RAPDPCR反应体系，使用筛选出的11个引物扩增出了142条DNA条带，其中多态性条带134条，多态性比例很高，说明RAPD技术可以用于斑玉蕈不同菌株亲缘关系的鉴定。根据RAPD对供试菌株的扩增结果，不同菌株间的扩增图谱有明显的差异，因此所选引物可用于斑玉蕈不同菌株的快速鉴定，但由于RAPD技术仍存在不足之处，还需将其进一步转化为SCAR标记才可以更加准确地对菌株进行鉴定[15]。

通过对遗传距离及RAPD图谱的分析，两个白色野生型菌株单独聚为一类，表明RAPD技术可以有效地将不同颜色的斑玉蕈菌株区分。5号菌株与其他所有菌株遗传距离较远，单独聚为一类，这与董岩等的研究结果一致[16]。推测其原因可能是5号菌株从国外引进，与其他来源于国内的斑玉蕈菌株的遗传背景存在差异，且5号菌株的子实体形态与其他菌株也存在较大的差异（表2）。白色突变菌株（19号）与原褐色野生型菌株（20号）在RAPD图谱中聚为一类，且相似系数为100%，在IGS2测序分析中，两个菌株的序列相似度同样为100%，这一结果表明19号菌株确实由20号菌株突变而来。

本研究表明，IGS2分析与RPAD技术相结合的方法准确可靠，其中RAPD技术较IGS2分析具有更加丰富的多态性，能够在DNA水平上鉴别不同菌株是否存在差异，为科学、准确地判断特定菌株的特异性奠定了基础。

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