响应面分析法对α-淀粉酶抑制剂筛选方法的优化

许云青，龙盛京

（广西医科大学药学院，广西南宁530021）

随着世界人口老龄化，糖尿病已经成为一种严重影响健康的常见病、多发病，是继肿瘤、心脑血管疾病之后的第三位杀手。在我国，糖尿病发病率近10年逐年上升，平均每年增加100多万，其中Ⅱ型糖尿病占到90%以上，Ⅰ型糖尿病不到10%[1]。在Ⅱ型糖尿病的治疗中α-淀粉酶抑制剂发挥着重要的作用。α-淀粉酶抑制剂能抑制肠道内唾液、胰淀粉酶的活性，阻碍或延缓人体对食物中主要碳水化合物的水解和消化，降低食物淀粉糖类物质的分解吸收，降低血糖，抑制血糖浓度的升高，从而有利于糖尿病患者的饮食治疗。对于肥胖患者，可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗以减轻体重[2]。国外已经把α-淀粉酶抑制剂应用在减肥和保健食品上[3]。因此筛选和寻找安全、有效的α-淀粉酶抑制剂仍是药物学家们关注的热点之一。

目前在α-淀粉酶抑制剂的体外筛选实验中，α-淀粉酶的主要来源多为胰α-淀粉酶，胰α-淀粉有着来源不易、成本高等缺点。α-淀粉酶抑制剂测定方法多采用3，5-二硝基水杨酸法，其测定原理：α-淀粉酶抑制剂特异性地抑制α-淀粉酶，减少α-淀粉酶对淀粉水解，使得淀粉降解产物减少，3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原的棕红色氨基化合物减少，在一定波长下吸光度值降低。通过对添加抑制剂前后生产还原糖的量进行定量测定，可从前后变化测得α-淀粉酶抑制剂的活性[4]。在Bemfeld法[5]测定α-淀粉酶活性中，要求调整抑制剂及α-淀粉酶液浓度使得A值在0.4～0.7之间，范围较窄，不利于比较不同抑制剂活性及量效关系。本实验以工业α-淀粉酶代替胰α-淀粉酶，运用响应面分析法对原有的Bemfeld法进行优化设计，优化后的方法稳定可靠、实用，可运用于α-淀粉酶抑制剂的筛选。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

α-淀粉酶 天津福辰试剂厂，批号：20120502，酶活力单位1000～2000U/mg；可溶性淀粉 天津市大茂化学试剂厂；阿卡波糖 规格：每片50mg，拜耳医药保健有限公司，批号：H19990205；3，5-二硝基水杨酸 成都科龙化学试剂厂，批号：20120701；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、丙三醇 均为国产分析纯；药材水提物 待测样品，笔者自提；α-淀粉酶液 用0.2mol·L-1磷酸缓冲液配制，现配现用；可溶性淀粉液 用0.2mol·L-1磷酸缓冲液配制，现配现用；3，5-二硝基水杨酸试液 取3，5-二硝基水杨酸6.5g，加入325mL的2mol·L-1氢氧化钠和45mL丙三醇，加蒸馏水至1000mL，溶解，室温存放备用。

紫外可见分光光度计、扭力托盘天平 上海精密科学仪器有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；漩涡混合器 江苏海门麒麟医用仪器厂；超声仪 昆山市超声仪器有限公司；不锈钢电热恒温水浴 北京市医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 a-淀粉酶活性测定体系的测定方法 α-淀粉酶活性的测定采用Benfield法[5]：总反应体系为1mL[6]。取0.2mL α-淀粉酶于试管中，加入0.4mL可溶性淀粉液，加入0.4mL磷酸缓冲液（测定抑制率时为0.2mL样品液+0.2mL磷酸缓冲液），充分混匀，置于50℃水浴中孵化30min后，加入6.5g·L-1的3，5-二硝基水杨酸显色剂3.0mL，混匀，于沸水浴中反应10min，室温冷却，取其反应液0.5mL，加入蒸馏水4.5mL，混匀。在紫外可见分光光度计520nm波长下测定吸光度值。酶的抑制率按下式计算：

1.2.2 影响α-淀粉酶活性的单因素考察 α-淀粉酶的活性测定的影响因素主要为pH、底物浓度、酶浓度、酶与底物浓度的比例、温度、金属离子等，影响酶活性的金属离子较多，本文在此不做研究，主要对pH、底物浓度、酶浓度、酶与底物浓度比例、温度进行探讨。本次实验所用α-淀粉酶的最适温度为50～70℃，因此在最终确定孵化温度之前所用的孵化温度均为50℃。

1.2.2.1 缓冲体系pH的确定 配制pH范围为5.8～7.6的磷酸盐缓冲体系，10g·L-1的α-淀粉酶液及2%可溶性淀粉液用蒸馏水配制。按1.2.1α-淀粉酶活性的测定方法，测定α-淀粉酶在此pH范围的活性变化。

1.2.2.2 α-淀粉酶浓度的选择 用1.2.2.1中确定的0.2mol·L-1pH6.6的磷酸缓冲液配制浓度为0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g·L-1的α-淀粉酶溶液，然后各取0.2mL，再用0.2mol·L-1pH6.6磷酸缓冲液补充至1mL，混匀。按1.2.1方法，测定A520nm的值，绘制曲线。

1.2.2.3 可溶性淀粉浓度的选择 用0.2mol·L-1pH6.6的磷酸缓冲液配制含0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、15.0、16.0、18.0、20.0g·L-1的可溶性淀粉液，然后各取0.4mL，再用0.2mol·L-1pH6.6磷酸缓冲液补充至1mL，混匀。按1.2.1方法测定A520nm，绘制曲线。

1.2.2.4 体系中α-淀粉酶与可溶性淀粉比例的确定在1.2.2.2中确定1mL反应体系中α-淀粉酶的终浓度为10g·L-1后，按照1.2.1的操作方法考察不同浓度淀粉液对酶活性测定中A值范围的影响。

(1)加强对品管圈护理人员与患者的教育与知识宣传,向患者讲解内瘘穿刺的原理方法以及在穿刺时对患者的要求,并鼓励家属共同参与,提高护理人员及患者对内瘘穿刺点渗血的认识,以达到减少并尽量避免动静脉内瘘穿刺点渗血的效果。

1.2.2.5 孵化温度的确定 用0.2mol·L-1pH6.6的磷酸缓冲液配制浓度为10g·L-1α-淀粉酶液及2%可溶性淀粉液。按照1.2实验操作方法测定不同孵化温度对酶活性的影响。

1.2.3 采用响应面法优化α-淀粉酶活性的测定 根据Box-Benheken中心组合实验原理，综合各单因素对α-淀粉酶活性影响的大小，最终选择酶-淀粉比例、缓冲pH、孵化温度

3个因素，以测定的吸光度值为响应值，在单因素实验的基础上，最终确定A（酶-淀粉比例）、B（缓冲pH）、C（孵化温度）的水平值，响应面分析的因素与水平表见表1。

表1 响应面分析的因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface method

1.2.4 中药水提物对α-淀粉酶活性影响 取中药材粉末10.00g，加入100mL蒸馏水，95℃水浴提取30min，过滤，残渣加入80mL蒸馏水，95℃水浴提取30min，过滤，残渣加入60mL蒸馏水，95℃水浴提取30min，过滤，合并三次滤液，定容至250mL，取实验用量离心，作为待测液。在选定最佳条件下，按照1.2.1实验方法，在1mL反应体系中测定待测液对α-淀粉酶的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察

2.1.1 磷酸缓冲体系pH的确定 体系的pH对酶活力影响较大，通常在最佳pH下，酶相对比较稳定，在此条件下反应能最大程度发挥酶的活力，提高酶反应效力。从图1的结果得出，pH在6.2～6.6区段α-淀粉酶活性基本保持不变，pH6.8后，随pH增大，酶活性减小。所以选取pH为6.6左右。

图1 α-淀粉酶活性与pH的关系Fig.1 The relationship between α-amylase and pH

2.1.2 α-淀粉酶浓度的选择 1mL反应体系中，加入浓度为0.1～10g·L-1α-淀粉酶，结果表明，不同浓度的α-淀粉酶对反应体系的影响不大，吸光度值在0.055～0.06微小范围内变化。本实验所用的α-淀粉酶活单位为1000～2000U/mg，活性较低，为保证整个反应系统的完全反应，本实验选择α-淀粉酶的浓度为10g·L-1。

图2 不同浓度α-淀粉酶对系统本底A值的影响Fig.2 Effect of different α-amylase content on A520nm

2.1.3 可溶性淀粉浓度的选择 1mL反应体系中，加入可溶性淀粉浓度为0.1～20.0g·L-1，结果表明淀粉浓度对系统A值影响较大，随淀粉浓度增大吸光度值增大。

图3 不同浓度淀粉对系统本底A值影响Fig.3 Effect of different starch content on the absorbance at 520nm

2.1.4 体系中α-淀粉酶与可溶性淀粉比例的考察 在无α-淀粉酶抑制剂存在时，系统反应A值在0.8～1.4范围有利于抑制剂活性强弱的比较。所以本实验选择A值在1.2左右时的淀粉浓度（15g·L-1）。在1mL反应体系中确定α-淀粉酶和可溶性淀粉的浓度比为1∶1.5左右。

图4 酶-淀粉液不同比例对反应体系A值影响Fig.4 Effect of different the proportion of the enzyme starch solution on the absorbance at 520nm

2.1.5 孵化温度对α-淀粉酶活性的影响 酶的活性受温度影响较大，实验结果显示孵化温度为55～60℃时，温度对酶活性的影响基本保持不变，温度大于60℃后，随温度增加体系A值减小。温度太低或太高，均对α-淀粉酶活性不利，本实验选取中间温度即55℃左右。

图5 不同孵化温度下反应体系A520nmFig.5 Effect of different temperature on A520nm

2.2 响应面分析结果

2.2.1 响应面设计方案 响应面实验设计结果及分析见表2。

表2 响应面分析实验结果Table 2 Results of response surface central composite design

2.2.2 回归方程和方程分析 Box-Behnken实验拟合出的回归方程为：

Y=-5.2286+0.2468A+0.017B+0.013C+0.02AB-0.018AC+0.0045BC+0.053A2-0.095B2-0.023C2

回归方程各项的方差分析见表3。

由表3可知，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r=模型平方和/总离差平方和[7]，即r=0.9904），模型的显著水平小于0.0001，说明此模型是高度显著的，该实验方法是可靠的。从回归方程各项的方差分析可以看出，方差的失拟项较小，而且不显著，表明该方程对实验结果拟合良好，实验结果误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。从显著性可以看出，α-淀粉酶与可溶性淀粉比例对α-淀粉酶活性的影响最为显著。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANONA（analysis of variance）of terms of regression equation

2.2.3 响应面图分析 RSM方法图形是特定的响应面Y值对应的因素A、B、C构成的一个三维空间在二维平面上的等温图，可以直观地反应各因素对响应面值的影响，从实验所得的响应面分析图上可以找到其在反应过程中的相互作用[8]。回归响应面曲线见图6。

图6直观反映了各因素对响应值的影响，比较可知：酶-淀粉比例对α-淀粉酶的活性影响大，表现为曲线较陡。各因素的交互作用不显著。

预测最优条件：pH6.54、孵化温度55.94℃、酶-淀粉比例1∶2，吸光度值达1.69，考虑到操作便利，α-淀粉酶活性测定选取pH6.6，孵化温度55℃，酶-淀粉比例1∶2。按照此条件平行三次验证实验，得到平均吸光度值为1.63，与预测值（1.69）基本相符合。酶-淀粉比值为1∶2时，吸光度值大于1.4，不利于抑制活性强弱比较，所以选择次优值，控制吸光度值在1.2左右。由于酶-淀粉比例对α-淀粉酶活性影响最大，最终选取酶-淀粉比例为1∶1.5，此时的预测值为1.259。选定pH6.6、孵化温度55℃、酶-淀粉比例1∶1.5测定吸光度值，平行三次实验，平均结果为1.222，与预测值（1.259）基本相符。且此吸光度值利于在比色测定时抑制剂对α-淀粉酶抑制作用的分辨。最终选择条件磷酸缓冲液pH6.6、孵化温度55℃、酶-淀粉比例1∶1.5。

2.2.4 中药材水提物对α-淀粉酶活性影响 结果见表4。实验表明黄芪对α-淀粉酶有明显抑制作用，牛蒡子、桑寄生、玄参、乌梅、鸡血藤对α-淀粉酶无明显抑制作用。6种药材对α-淀粉酶抑制作用均小于阿卡波糖。

图6 回归优化响应面曲线图Fig.6 Optimization of response surface by regression

表4 中药水提液对α-淀粉酶活性的影响Table 4 Effect of water-extract from traditional Chinese medicine onα-amylase activity

3 结论

本实验对Bemfeld法中pH、孵化温度、α-淀粉酶浓度、可溶性淀粉浓度及α-淀粉酶与可溶性淀粉比例进行一系列考察，并运用响应面分析法进行优化组合，最终确定反应体系的最佳条件为：pH6.6、孵化温度55℃、α-淀粉酶-可溶性淀粉比例1∶1.5。

原测定法中要求A值测试区间设在0.4～0.7之间，范围较窄，不利于比较不同抑制剂活性剂量效关系。目前国内常见的可见分光光度计多采用每毫米1200条衍射光栅，光度范围达到2.5A，光度值也提高到0.5%T，因此在0.2～1.5范围内测定A值，误差影响不大[6]。本实验运用响应面分析法，结合使用可见分光光度计，优化模型测定体系，提高了A值的测定范围，更有利于比较α-淀粉酶抑制剂活性强弱的研究。优化后的α-淀粉酶抑制剂测定方法适用范围广，通过重复实验证明此模型稳定、通过中药水提液及阳性对照物阿卡波糖对α-淀粉酶抑制作用实验证明此模型可行。表明本实验优化后的测定方法可运用于α-淀粉酶抑制剂的筛选。

[1]陈浙江，袁萍，叶晓平，等.治疗糖尿病常用中药对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性研究[J].中成药，2008（11）：1661-1664.

[2]赵蓉，李多伟，沈晓东，等.白芸豆中α-淀粉酶抑制剂的研究[J].中成药，2008，30（9）：3.

[3]Sharma A，Gupta M.Three phase partitioning as a largescale separation method for purification of a wheat germ bifunctional protease/amylase inhibitor[J].Process Biochemistry，2001，37（2）：193-196.

[4]赵蓉，李多伟，任涛，等.Dns比色法测定白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的方法研究[J].中成药，2013（3）：573-576.

[5]贾光锋.Α-淀粉酶抑制剂的制备及检测[J].食品与药品，2007（2）：34-36.

[6]赵修南，贾启燕，单俊杰.Α-淀粉酶抑制剂筛选方法的优化[J].国际药学研究杂志，2008，35（5）：4.

[7]魏锐，田惠玲，周建军，等.响应面分析法优化杜仲叶中绿原酸水提工艺[J].安徽农业科学，2011，39（7）：3965-3967，3970.

[8]李盈蕾，陈建华，孙吉佑，等.响应面分析法优选黄花菜多糖提取工艺[J].中国酿造，2010（7）：72-74.