四角蛤蜊废弃肉渣制备ACE抑制肽的工艺研究

刘 睿，朱蕴菡，贾梦蛟，王令充，王欣之，吴 皓，*

（1.南京中医药大学药学院，南京210023；2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，南京210023）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）属于软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），真瓣鳃目（Eulamellibranchia）蛤蜊科（Mactridae），是一种广泛分布于我国南北各海区的较大型低值经济贝类，江苏省为四角蛤蜊的优势产地。传统中医药理论认为四角蛤蜊可药用，明李时珍《本草纲目》记载：蛤蜊肉“止消渴，开胃，治老癖，能为寒热及妇人血块”。研究表明，四角蛤蜊具有调节免疫、辅助降血糖、抗氧化等功效[1-3]。

本课题组基于全值化综合利用的研发理念，将四角蛤蜊加工过程中的废弃肉渣进行酶解制备活性肽。与化学药物相比，活性肽具有生物活性高、毒副作用小等优势，而海洋生物活性肽，因其来源广泛，资源充足，受到越来越多科研工作者的关注。前期研究表明四角蛤蜊肉渣酶活性肽具有抗氧化、抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）等作用[4]，本文进一步优化四角蛤蜊酶解活性肽的制备工艺，为进一步开发低值贝类相关功能产品奠定实验基础。同时，为食品或功能产品加工过程中产生废弃物的综合开发利用提出研究方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四角蛤蜊样品为三龄贝 贝重（30±10）g，由江苏省海洋水产研究所于启东市吕四港镇袁灶水产养殖场取样并保存，雌雄随机，批号：20100103，经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蛤蜊科动物四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve）；四角蛤蜊肉渣 实验室提供；胰蛋白酶（50000U/g） 国药集团化学试剂有限公司；ACE（从兔肺提取）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（HHL） 美国Sigma-Aldrich公司；马尿酸 中国药品生物制品检定所；乙腈 美国Tedia公司；三氟乙酸 国药集团化学试剂有限公司；其余试剂 均为国产分析纯。

BP 211D电子天平 德国Sartorious公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机 江苏省金坛市荣光仪器制造公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市子华仪器有限责任公司；3-16PK高速冷冻离心机 德国Sigma公司；RotavaporR-210旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司；pHs-3C型精密pH计 上海精密科学仪器有限公司；Unique-s15超纯水仪 厦门锐思捷科学仪器有限公司；Waters e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；Xbridge-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm） 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 四角蛤蜊肉渣酶解肽的制备 将四角蛤蜊软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次45min，沥干。取水煎后沥干水的四角蛤蜊肉渣称重，加3倍量水匀浆，胰蛋白酶在45℃，pH8.5，加酶量0.25%酶解2h。酶解结束后于沸水浴灭活15min，然后于10000r/min，4℃离心20min，取上清液进行超滤，截留分子量为50ku以下的超滤液为酶解肽。

1.2.2 ACE抑制率的测定 参照文献[5]，取样品冻干粉适量溶于0.1mol/L硼酸缓冲液（含0.3mol/L NaCl，pH8.3）制成相应的样品液。ACE、HHL分别用0.1mol/L硼酸缓冲液（含0.3mol/L NaCl，pH8.3）配成100mU/mL ACE溶液和5mmol/L HHL溶液。将30μL HHL和10μL样品（或缓冲溶液）混匀后，于37℃保温5min，再加入20μL的ACE启动反应，混匀后继续于37℃下反应1h，迅速加入70μL HCl（1mol/L）终止反应，用高效液相色谱分析结果。同时用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。

色谱条件：Xbridge-C18柱（4.6mm×250mm，5μm，美国Waters公司）；流动相：A为0.05%三氟乙酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱条件：0～40min，B流动相10%～60%，流速：0.8mL/min；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

ACE抑制率（%）=[1-（Ai/Aj）]×100

式中：Ai为样品组马尿酸峰面积，Aj为空白组的马尿酸峰面积。

1.2.3 单因素实验 选择胰蛋白酶酶解，酶解过程中比较酶解温度、酶解pH、加酶量、酶解时间对ACE抑制肽制备的影响。以产物对ACE抑制率为指标，筛选酶解工艺条件。

1.2.3.1 温度的影响 在加酶量0.25%，pH8.5，酶解时间2h的条件下，实验分别考察了40、45、50、55、60℃制备酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.2 酶解pH的影响 在酶解温度45℃，加酶量0.25%，酶解2h条件下，分别考察的pH为7.0、7.5、8.0、8.5和9.0时，所得酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.3 加酶量的影响 在pH为8.5，温度45℃，酶解2h条件下，分别考察按加酶量占肉渣重量的百分比计分别为0.05%、0.1%、0.25%、0.5%和0.75%时，所得酶解物的ACE抑制率。

1.2.3.4 酶解时间的影响 在pH为8.5，温度45℃，加酶量0.5%条件下，考察酶解反应时间对酶解产物ACE抑制活性的影响实验，分别考察1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h酶解得到的四角蛤蜊酶解物的ACE抑制活性。

1.2.4 响应面分析法研究胰蛋白酶酶解工艺 参照文献[6]，在单因素实验基础上，以ACE抑制率为响应值，选择酶解温度（A）、加酶量（B）和pH（C）三个因素，对工艺条件使用中心点对称（Central Composite）的响应面设计进行优化，响应面实验设计因素水平表见表1。

表1 响应面因素水平实验设计Table 1 Experiment design of factors and levels of response surface method

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 温度的影响 ACE抑制活性与酶解程度密切相关，不同酶解工艺会影响酶解肽的活性。其中体系温度是影响酶促反应的重要因素之一，温度的高低直接影响着蛋白酶的稳定性与反应活性，而当反应温度过高，可能会引起蛋白质变性，使得酶活力明显降低。从图1中可看出，当温度在45℃时，ACE抑制率达峰值，随着温度升高，胰蛋白酶活力不断降低，因此反应温度达到45℃时，接近胰蛋白酶最适酶解温度，依据结果选择45℃作为进一步响应面分析的中心点。

图1 酶解温度对酶解肽ACE抑制活性的影响Fig.1 Effect of various temperatures on ACE inhibitory activity

2.1.2 酶解pH的影响 不同蛋白酶的最适pH亦不同，pH的改变可使蛋白酶空间结构发生变化，导致活性改变；不同pH还可能改变底物解离状态，从而影响底物与酶的结合，改变酶促反应的进程。根据图2结果分析，不同pH对酶解物的ACE抑制活性有影响，可能由于不同pH条件下，酶解程度不同使得酶解产物活性有差异。从图2中可看出，pH为8.5时，ACE抑制率达峰值；当pH达到9.0时，ACE抑制率下降。胰蛋白酶在其最适酶解pH时的酶解效果最佳，当高于或低于最适pH时均影响酶解效果。因此选择pH8.5作为响应面分析的中心点。

图2 pH对酶解肽ACE抑制活性的影响Fig.2 Effect of enzymatic pH on ACE inhibitory activity

2.1.3 加酶量的影响 高效性是酶促反应的特点之一，少量的酶即可以产生显著的催化效果，从图3中可看出，不加酶时匀浆液滤过组分的ACE抑制率仅为19.50%，而在加酶量为0.05%时酶解物的ACE抑制率即可高达64.18%；随着加酶量的增大，酶解物的ACE抑制率逐渐增加，在加酶量增大到0.5%时，酶和底物接近最佳比例，再提高加酶量不会改变酶解反应进程，ACE抑制率基本维持不变。因此，选择加酶量0.5%为响应面分析的中心点。

图3 加酶量对酶解肽ACE抑制活性的影响Fig.3 Effect of various enzymatic concentrations on ACE inhibitory activity

2.1.4 酶解时间的影响 酶解过程中，酶解时间会影响酶解产物的水解度，从而影响酶解产物的生物活性，因此需确定合适的酶解时间。从图4中可看出，随着酶解时间延长，酶解效率提高，ACE抑制率逐渐增加，反应时间在2h时ACE抑制率处于峰值，当时间超过2h时，ACE的抑制活性反而降低，这可能由于酶解产物水解度不同导致活性不同。结果表明，2h的酶解时间选择为最佳。

图4 酶解时间对酶解肽ACE抑制活性的影响Fig.4 Effect of various enzymatic time on ACE inhibitory activity

2.2 响应面法优化酶解条件

2.2.1 响应面实验设计及结果 根据实验结果，考虑酶解时间对ACE抑制活性影响较小，选择酶解温度（A）、加酶量（B）和pH（C）三个因素进行响应面分析。以Design-Expert软件设计响应面实验方案，以ACE抑制活性为响应指标，建立数学回归模型，对酶解工艺进行优化，同时分析不同因素间的交互作用。

根据实验结果得到回归方程：Y=76.18+0.64A+3.61B－1.01C－0.61AB－0.13AC+1.68BC－0.44A2－3.20B2－1.45C2。

表2 Central composite响应面设计方案与实验结果Table 2 Process variables and levels in central composite design arrangement and response values of ACE inhibitory activity of products

由表3方差分析可知，模型显著（p值＜0.05），失拟项不显著（p值＞0.05），表明未知因素对实验干扰小，说明残差均由随机误差引起，说明模型拟合度良好，实验误差小，建立的模型能够反映响应值变化。酶解温度（A）、加酶量（B）和pH（C）对实验结果的影响均显著（p值＜0.05）。交互项AB，二次项A2，一次项A对响应值ACE抑制率影响显著，一次项B、C，交互项BC，二次项B2、C2对响应值ACE抑制率影响极显著，交互项AC对ACE抑制率的影响不显著，表明酶解温度（A）与加酶量（B）之间存在交互作用，达到显著水平；加酶量（B）与pH（C）之间存在交互作用，达到极显著水平。按照对ACE抑制活性影响大小对三个因素排序，结果为：加酶量＞pH＞温度。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

依据建立的模型及实验结果，确定最佳酶解工艺条件为：四角蛤蜊肉渣匀浆液加入0.60%胰蛋白酶，调节pH 8.50，在温度48℃，酶解时间为2h。以确定的最佳工艺参数条件进行验证实验，平行3次验证实验，测得ACE抑制率为分别为77.98%，76.10%和77.16%，平均值为77.08%，与预测值77.22%的相对误差为0.18%，与预测值无显著性差异，证明响应面法切实可行，对于酶解肽工艺优化具有指导意义。

本文研究对象为江苏沿海优势低值贝类四角蛤蜊，江苏省每年产量约占全国总量的1/3，资源丰富。目前四角蛤蜊的开发仍以简单食品加工或鲜食为主，缺少系统开发与综合利用，本课题组致力于江苏沿海低值贝类的综合开发利用研究，充分合理开发低值贝类，以形成低值贝类全值化综合利用的产业链，前期研究将四角蛤蜊软体提取精制获得四角蛤蜊多糖，用于开发具有调节免疫及辅助降血糖的功能产品[7]，而经过提取的肉渣作为废弃物丢弃不仅污染环境，且造成资源浪费。因此，本课题对四角蛤蜊肉渣进行酶解，充分利用四角蛤蜊资源，制备具有抗氧化、ACE抑制作用的酶解肽。

3 结论

本文用响应面法优化四角蛤蜊肉渣酶解工艺，建立了四角蛤蜊肉渣酶解的二次多项式数学模型。利用响应面对酶解物制备的各因素及其交互作用进行了分析，确定最佳工艺为：四角蛤蜊肉渣匀浆液加入0.60%胰蛋白酶，调节pH8.50，在温度48℃，酶解时间为2h，在最佳工艺条件下获得的酶解物的抑制率为77.08%，与预测值77.22%基本吻合，表明本文方法合理可行。

[1]Wang LC，Zhang K，Di LQ，et al.Isolation and structural elucidation of novel homogenous polysaccharide from Mactra veneriformis[J].Carbohydr Polym，2011，86（2）：982-987.

[2]Luan HM，Wang LC，Wu H，et al.Antioxidant activities and antioxidative components in the surf clam，Mactra veneriforms[J].Nat Prod Res，2011，25（19）：1838-1848.

[3]栾合密，吴皓，方东，等.蛤蜊化学成分及其生物活性研究进展[J].中国海洋药物，2008，27（6）：57-61.

[4]朱蕴菡，刘睿，王令充，等.四角蛤蜊酶解肽抑制ACE活性与抗氧化活性研究[J].南京中医药大学学报，2013，29（2）：173-175.

[5]Chen JW，Wang YM，Zhong QX，et al.Purification and characterization of a novel angiotensin-I converting enzyme（ACE）inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp protein[J].Peptides，2012，33：52-58.

[6]刘博群，林松毅，于志鹏，等.基于响应面法优化蛋清蛋白质降压肽的制备工艺[J].食品科学，2009，30（16）：172-176.

[7]王令充，吴皓，张坤，等.四角蛤蜊的降血糖、保肝和免疫活性研究[J].南京中医药大学学报，2010，26（4）：283-285.