谷氨酸转运体在高热惊厥大鼠脑内的表达及意义

周蕊　孙妍　李俊利

【摘要】 目的 探讨大鼠反复高热惊厥后脑内谷氨酸及谷氨酸转运体的表达情况，进行定性及定量分析。方法 热水浴法建立FS模型。15日龄雄性Wistar大鼠60只，随机分为正常对照组（n=10）和高热处理组（n=50），其中高热处理组按大鼠是否有惊厥又分为高热未惊厥组和高热惊厥组。免疫组织化学法检测谷氨酸及谷氨酸转运体在大鼠脑组织各区的表达。结果 ①惊厥对照组大鼠皮层及海马CA3区Glu的表达较正常对照组明显增加。②惊厥对照组大鼠皮层及海马CA3区GLT-1的表达均低于正常对照组。讨论 高热惊厥时脑细胞谷氨酸表达上升，而脑细胞膜和细胞间质中的谷氨酸转运体GLT-1表达下降。

【关键词】 高热惊厥；谷氨酸；谷氨酸转运体

高热惊厥（febrile convulsion，FC）是一种特殊类型的癫痫综合征，是小儿时期最常见的惊厥性疾病，但反复发作或长时间发作的FC可造成脑损伤，目前对本病的研究仍集中于对其行为及脑电图变化的观察，而对其神经病理改变的研究较少。本研究用热水浴惊厥模型诱导生后15dWester大鼠发生热性惊厥，利用免疫组织化学方法对正常对照组、高热及高热惊厥组大鼠脑内谷氨酸及谷氨酸转运体的表达情况进行定性及定量分析，为热性惊厥时的神经病理学研究提供新思路

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 15日龄雄性Wistar大鼠60只，体重30-45g，（购自内蒙古大学实验动物中心）。自由喂养1d后进行实验。将大鼠称重后编号，随机分为正常对照组（37.0℃水浴，n=10）和高热处理组（45.2℃水浴，n=50），其中高热处理组按大鼠是否有惊厥又分为高热未惊厥组和高热惊厥组。从正常对照、高热未惊厥和高热惊厥组中，分别随机取10只用于进行脑组织免疫组织化学染色观察。

1.2 化学试剂 本实验中所采用的化学试剂及免疫组化试剂盒分别购自北京化学试剂公司及福州迈新生物科技公司。

1.3 热性惊厥动物模型的建立 参照文献报道[1]建立热性惊厥动物模型，高热惊厥组热水浴：水浴箱温度设定为45.2℃。从大鼠生后15d开始，隔日诱导惊厥1次，共10次。正常对照组水浴温度为37℃，处置方法同高热惊厥组。记录大鼠的惊厥潜伏期、惊厥时体温、惊厥持续时间及惊厥级别评[2]（惊厥分级：0级0分：无惊厥；1级1分：面部抽动；2级2分：点头；3级3分：前肢阵挛抽搐；4级4分：全身强直；5级5分：全身强直阵挛）。

1.4 脑组织谷氨酸和谷氨酸转运体表达检测

1.4.1 脑标本取材和切片制备并进行免疫组化染色 各组在FC组末次惊厥24h予100g/L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛PB左心室灌注固定，取脑，后固定6-8h。脑标本入30%蔗糖磷酸缓冲液（PH=7.4）过夜自头端向尾端连续冻切脑片，厚30μm切片，连续取片，三张为一套，分别进行尼氏染色组织定位和Glu及GLT-1免疫组化染色。

1.4.2 图像结果处理 每张切片分别在海马CA3区、颞叶皮层（CTL）随机观察5个不连续视野（×400），使用Olympus自动图像采集系统进行图像采集，脑片呈现棕黄色区域为阳性反应，用IPP软件分析系统进行计数和平均光密度分析，取其OD值。

1.5 统计学分析 应用SPSS12.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（χ±s）表示，独立样本t检验和单因素方差分析进行组间比较，以P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 热水浴诱导大鼠惊厥结果 正常对照组大鼠在37.0℃水浴中，游动自如，出水前后无异常变化。高热惊厥组大鼠在45.2℃热水中，每次诱导均发展为惊厥，惊厥时的时体温在42℃-44℃之间，平均体温为（42、8±0、4℃），第1次惊厥发作最长潜伏期为5min57s，以后隨诱发次数的增加，惊厥阈值逐渐降低，惊厥潜伏期呈缩短趋势（第2-10次，最长惊厥潜伏期分别为5min30s、5min19s、4min51s、4min35s、4min2s、3min45s、3min25s、3min4s、2min47s、）。但惊厥发作程度及发作时间无显著趋势性变化。总的惊厥级别多为4-5级。惊厥发作3次后，部分大鼠出现行为改变，表现为易激惹，攻击性强或反应迟钝、活动减少。

2.2 谷氨酸（Glu）、谷氨酸转运体（GLT-1）在大脑皮层及海马的表达 惊厥对照组大鼠皮层及海马CA3区Glu的表达较正常对照组明显增加，表现为计数、平均光密度与正常对照组相比增加有统计学意义（P<0.01），见表1。惊厥对照组大鼠皮层及海马CA3区GLT-1的表达均低于正常对照组，表现为计数、平均光密度值较正常对照组明显减少（P<0.01），见表2。

3 讨 论

人类热性惊厥多发于6个月-3岁，研究表明，生后5-7d大鼠的脑发育程度与足月新生儿的脑发育程度相当，15d大鼠的脑发育程度与1岁儿童相当，28-30d大鼠的脑发育程度与2岁儿童相当[3]。大鼠55d左右进入青春期，60d性成熟。本研究中的大鼠从15日龄开始，反复诱发热性惊厥，其年龄段与人类热性惊厥的好发年龄相当，模拟人类有热惊厥史的癫痫发作。

本研究利用热水浴诱导大鼠FC模型，每2d诱导大鼠FC发作1次，观察到大鼠惊厥行为、惊厥时的体温、潜伏期及惊厥持续时间均与Jiang等[2]的报道相符，此外，热水浴诱导模型所需器材简单，水温等因素较易控制，本研究观察大鼠FC3周，Jiang等观察大鼠FC时间长达半年，所以该模型是一简便易行的FC模型，并适合于长期观察与研究。

谷氨酸转运体（GluTs）是位于神经元和胶质细胞膜上的一种糖蛋白，在谷氨酸的再循环，维持突触的正常传递及保护神经元免受神经兴奋毒性损害等方面有重要作用。到目前为止，已分离和克隆出五种亚型，即EAAT（EAAT1-EAAT5），EAAT2也称为GLT-1，在中枢神经分布广泛，也表达在发育阶段的神经元上。其转运的谷氨酸占全部谷氨酸摄取的90%在生理条件下，EAAT迅速摄取谷氨酸，有效地抑制了细胞外谷氨酸的堆积。病理情况下，EAAT对谷氨酸的摄取能力下降或者中断，甚至出现向细胞外的逆转运，导致细胞外谷氨酸浓度上升，兴奋谷氨酸受体，引发一系列兴奋性毒性。热性惊厥时脑缺氧、缺血，谷氨酸由于过度释放或摄取障碍而大量积聚，使其脑内浓度急剧升高，引起突触间隙或胞外Glu大量蓄积，通过作用于相应的谷氨酸受体（GluRs）导致Na+、Ca2+内流增加，使细胞急性渗透性肿胀以及细胞内Ca2+超载，能量消耗、自由基大量形成，严重或反复发作将造成脑损伤。本实验中，热水浴大鼠产生了与文献报道相一致的发热乃至惊厥，在此基础上，观察了皮层及海马CA3区Glu的表达变化，发现其有显著升高，而GLT-1的表达明显降低。因此上调GLT-1，增强其对于谷氨酸的摄取可能在热性惊厥的发生机制和防治中具有重要作用。

参考文献

[1] 周国平，秦炯，汤秀英，等.高热惊厥大鼠海马神经元数量和超微结构改变的实验研究[J].中华儿科学杂志，2001，39：105-108.

[2] Jiang W，Duong TM，DeLanerolle NC.Neuropathology of Hyperthermic seizures in the rat[J].Epilepsia，1999，（40）：5-19.

[3] 左启华，主编.小儿神经系统疾病[M].第2版.北京：人民卫生出版社，2002，231-232，425-426.