游离脂肪酸对糖尿病大鼠心肾病理改变的影响

王震静等

【摘要】 目的 对雄性Wistar糖尿病大鼠外源性输注脂肪乳，提高大鼠血液中游离脂肪酸（FFA）的浓度，观察大鼠在不同浓度游离脂肪酸作用下，心肌细胞直径的改变、肾小球体积的改变以及心肌和肾小球上白介素-6（IL-6）的不同表达。方法 制作糖尿病大鼠模型，按照随机数字表编号将DM大鼠分入对照组和实验组，颈静脉穿刺插管，在输液前后，分别经颈静脉内采血，分离血清，待检测，实验结束，分离心脏及两侧肾脏，测量左侧肾脏质量，将心肾组织用4%中性甲醛固定，制作切片，进行HE染色和免疫组化组织染色。EllisAE法检测血清FFA，光学显微镜下测量各组大鼠心肌细胞直径和肾小球面积，计算肾小球平均体积（VG）并计算肾重体重比值，测量各组的心肌和肾小球的IL-6光密度值，统计各组数据之间的差异是否有统计学意义及其相关系数。结果 ①实验组大鼠的血清FFA水平明显升高，比对照组升高2-4倍。实验组大鼠随着脂肪乳输注时间的增加，肾重体重比值渐变大，4天组、6天组有统计学意义，与游离脂肪酸相关系数为0.782，P<0.01。实验组大鼠的肾小球体积随着脂肪乳输注时间的增加而增加，自2天组开始肾小球体积增大有统计学意义，与血清中游离脂肪酸相关系数为0.837，P<0.01，与肾小球IL-6的表达相关系数为0.843，P<0.01。②对照组大鼠肾小球中IL-6基本不表达或弱表达，测量其平均光密度分别为0.1612、0.1583、0.1579；实验组大鼠IL-6水平较对照组明显增高，2天组、4天组、6天组光密度分别为0.2173、0.4409、0.5294，2天组开始就有统计学意义。③心肌细胞HE染色显示：实验组大鼠较对照组大鼠心肌细胞肥大，随着脂肪乳输注时间的延长，心肌细胞直径渐增大，4天组、6天组有统计学意义。随着脂肪乳输注时间延长，心肌细胞局部IL-6表达增多，自2天组就有统计学意义，与FFA浓度相关系数为0.753，P<0.01，与心肌细胞局部IL-6光密度水平相关系数为0.808，P<0.01。结论 游离脂肪酸引起糖尿病大鼠肾重体重比值增加、肾小球体积增大、肾小球局部IL-6表达增加，并且随着脂肪乳注射时间延长，上述改变明显。肾重体重比值和肾小球的改变可能与局部IL-6高表达相关。游离脂肪酸引起糖尿病大鼠心肌细胞肥大，随着FFA浓度的增加，肥大明显，肥大改变可能与局部IL-6表达相关。

【关键词】 Wistar大鼠；糖尿病；游离脂肪酸

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.004 文章编号：1004-7484（2013）-06-2863-02

1 材料和方法

1.1 实验动物及糖尿病动物模型的建立 健康雄性Wistar大鼠30只，6-8周龄，体重180-200g，由中国医科大学实验动物中心提供。（SPF级），普通饲料适应性喂養l周，后给予高脂饮食4周。

使用前临时配制STZ溶液。高脂饲料喂养4周后的大鼠，禁食12h过夜后，称重，按照40mg/Kg，腹腔注射1%STZ一次。继续高脂喂养72小时，血糖检测，空腹血糖（FBG）≥1l.lmmol/L者为DM大鼠，有28只经检验成模，进入实验。

1.2 研究对象和分组 按照随机数字表将大鼠分入输入生理盐水的对照组和输入脂肪乳的实验组。实验组继续给予高脂饮食一周，对照组普通饲料饲养。

1.3 方法操作

1.3.1 大鼠颈静脉穿刺插管手术 称重，用3%戊巴比妥钠（4mg/Kg）腹腔注射麻醉，暴露并分离右侧颈静脉，以PE50软质塑料管行颈静脉插管，插管深度约1-2cm。远端穿过皮下固定于颈背部皮肤处。

1.3.2 静脉输注 经大鼠颈背部导管采血后，静脉导管与微量输液装置连接，以微量输液泵24小时连续输注。FFA组（n=15）：输注20%英脱匹利特+肝素钠（英脱匹利特：肝素钠=lml：40UI），输注速率0.6-1ml/h，以维持循环中FFA水平高于基础值2-4倍，输液持续2-6天（FFA-2d：n=5，FFA-4d：n=5，FFA-6d：n=5）；NS组（n=13，NS-2d，n=5，NS-4d，n=4，NS-6d，n=4）以相同速率（0.6-1.0ml/h）连续静脉输注生理盐水。实验结束，经颈静脉内采血，分离血清，于-80℃冰箱保存，测定血FFA水平。

1.4 主要试剂与仪器

1.4.1 主要仪器 ①显微照相系统，日本奥林巴斯（Olympus，TurboScan）

②生物显微照相分析系统，（日本Olympus，BX51）。

1.4.2 试剂 ①血清游离脂肪酸试剂盒，上海研吉生物科技有限公司；②免疫组化试剂盒一抗、二抗、DAB显色剂均购于北京中杉生物技术有限公司。

1.5 切片制作 分离心脏、肾脏，左侧肾脏除去包膜称重，取心脏组织，肾脏组织固定于4%的中性甲醛中，制切片，并进行HE常规组织染色和IL-6免疫组化染色。

1.6 IL-6组织局部沉积 IL-6染色阳性物质为棕黄色，利用显微图像分析系统进行图像采集，分析肾小球内IL-6在组织局部表达的情况，可见对照组大鼠肾小球中IL-6基本不表达或弱表达，平均光密度分别为0.1612、0.1583、0.1579；实验组大鼠，肾小球中IL-6水平较对照组增高，2天组﹑4天组﹑6天组的光密度分别为0.2173、0.4409、0.5294，2天组开始就有统计学意义。

1.7 肾重体重比值和平均肾小球体积的计算 计算各对照组和实验各组中大鼠的肾重体重比值，得出，实验4天组肾脏体重比值开始有统计学意义，应用OlympusBX51分析系统测定各组大鼠HE染色肾小球等效直径和平均截面积（AG），据公式VG=l.38/1.1×AG3/2算出肾小球平均体积（VG），并计算其与游离脂肪酸的相关性，经PEARSON分析其相关系数为0.837。

1.8 心肌细胞直径（MCD）测定 将心肌切片在400倍光学显微镜下测定MCD，每张HE染色切片选取6-8个不重复的视野，每个视野测量5-10个心肌细胞，每一标本测量50个心肌细胞，以平均值作为该样本MCD进行分析。在被测定的心肌细胞，在横向上，细胞核位于细胞的中央，其最短径线为MCD[1]。2天组开始大鼠心肌细胞较对照组大鼠相比直增径大。心肌细胞直径与游离脂肪酸浓度的相关系数经PEARSON分析为0.789，与心肌局部IL-6水平的相关系数r为0.808。

1.9 统计学处理 定量结果用（χ±s）表示。采用SPSS13.0软件进行系统分析，组间比较采用t检验。相关性用PEARSON相关分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 论

2.1 随着脂肪乳输注时间的延长，糖尿病大鼠体内FFA浓度增高，肾重体重比值增加、肾小球体积增大，肾小球局部IL-6的表达指标—光密度也有增高趋势，肾脏的体积增大可能与局部IL-6高表达相关。

2.2 随着脂肪乳输注时间的延长，糖尿病大鼠体内FFA浓度增高，糖尿病大鼠心肌细胞直径变大，随着FFA作用时间的延长，肥大病变趋于明显，且局部IL-6表达增加，说明FFA可能引起心肌细胞肥大，并且程度与FFA浓度和持续时间呈正相关，机制可能与局部IL-6表达水平相关，见表1、表2。

3 讨 论

动脉粥样硬化是糖尿病患者常见的并发症，从病理生理学和流行病学的角度都能说明糖尿病与大血管疾病的密切关系。糖尿病大血管病变在组织病理学上与动脉粥样硬化并无差异，但其发生早、进展快、预后差，糖尿病大血管疾病的发生率和病死率更高。

FFA导致大血管病变的机制可能为：①FFA通过对NO生成的抑制，对血管内皮细胞的损伤，血管内皮功能失调是动脉硬化的始动因素。NO生成的减少，内皮细胞依赖性血管舒张功能受损，将启动和加速动脉粥样硬化病理过程发生。②FFA通过增加氧化应激产物损伤血管内皮。③FFA增加导致脂蛋白成分异常：在胆固醇酯转移蛋白存作用下，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的胆固醇和VLDL的TG交換增加，形成富含胆固醇的致动脉粥样硬化的VLDL和富含TG而胆固醇少的HDL、LDL。肝脂肪酶或脂蛋白酶水解富含TG的LDL，形成有着更强致AS作用的小而密VLDL。富含TG的HDL更易被肝脂肪酶水解而失去心血管保护作用[2]。

文中通过研究论述糖尿病大鼠肾重体重比值与肾小球体积的增大可能机制，以期待对于糖尿病肾病的发病原因做一探究，对糖尿病肾病的早期预防和治疗提供依据。

参考文献

[1] ItoH，et a1.ENC othelin ETA receptor antagonist blocks cardiac hypertrophy provoked by hemodynamic overload[J].Circulation，l994，89（5）：2198-2203.

[2] 杨文英.从脂毒性到糖尿病再到血脂异常[J].国外医学内分泌学分册，2004，24：287-288.

[3] 季宏，卞茸文，娄青林，等.颈动脉粥样硬化危险因素分析[J].南京医科大学学报，2006，26（9）.