芥蓝离体再生体系的优化

范爱丽　黄志鹏等

摘要：以芥蓝（Brassica oleracea）真叶和子叶段为外植体，研究了TDZ浓度、基因型及苗龄等因素对芥蓝不定芽再生的影响。结果表明，真叶和子叶段的最佳不定芽诱导培养基分别为MS+0.50～1.00 mg/L TDZ和MS+0.50 mg/L TDZ，真叶和子叶段再生频率分别达到82.56%和89.06%。最佳生根培养基为1/2 MS+0.10 mg/L NAA，其生根率达到100.00%，再生植株移栽成活率为96.00%。

关键词：芥蓝（Brassica oleracea）；TDZ；真叶；子叶段；离体再生

中图分类号：S635.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2171-03

芥蓝（Brassica oleracea）是起源于中国南方的一种特产蔬菜[1]，性喜冷凉，秋播冬收，主要食用花薹或嫩株，质脆可口，营养丰富且具有抗癌保健功效[2]。近年来全球气候变暖，高温胁迫导致芥蓝品质劣化、商品率降低。随着现代育种技术手段不断发展，通过离体诱变或基因工程方法可快速选育出芥蓝耐热种质或品种，提高芥蓝品质与产量。芥蓝组织培养是离体诱变和转基因的基础，芥蓝离体再生的外植体有茎段[3-5]、腋芽[6]、下胚轴[7-11]、子叶[12]和带柄子叶[13]。唐君等[11]将下胚轴经苯基噻二唑脲（TDZ）[14]浸泡预处理，而在培养基中添加高效诱芽激素TDZ对芥蓝真叶离体再生的影响尚未报道。

本研究探讨了TDZ浓度、基因型及苗龄等因素对芥蓝不定芽再生的影响，进一步优化芥蓝离体再生体系，旨在建立对芥蓝具有较广泛适应性的离体再生体系，为芥蓝无性系离体诱变和转基因进行育种工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

以黄花大笋芥蓝（J1）、正源大笋黄花芥蓝（J2）及自主杂交的F1芥蓝（J3）种子为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的培养 挑选子粒饱满的芥蓝种子，在超净工作台上先用体积分数70%的乙醇表面杀菌约1 min，再用10% NaClO溶液灭菌20～25 min，然后用无菌水反复冲洗4～5次，最后将种子平放于MS固体培养基表面（MS培养基均添加0.7%琼脂，3%蔗糖，pH 5.8，121 ℃灭菌20 min）。每瓶约10～15粒，放置于光照培养箱，培养温度（25±1） ℃，光照时间16 h/d，光照强度2 000 μmol/（m2·s），获得的无菌苗供切割外植体用。

1.2.3 不同基因型及苗龄对芥蓝外植体不定芽再生的影响 在最佳诱导培养基中，观察比较不同基因型芥蓝外植体J1、J2、J3不定芽的再生频率和再生系数，培养方法同上；在最佳诱导培养基中分别接种最优基因型芥蓝的不同苗龄（4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 d）外植体，培养方法同上。

1.2.4 不同浓度NAA对芥蓝外植体不定芽生根的影响 不定芽长到2～3 cm时，转入含有不同浓度NAA（0.00、0.10、0.30和0.50 mg/L）的1/2 MS生根培养基中，20 d后对生根效果进行观察对比，筛选出最适浓度。待基部形成大量的毛根后，打开三角瓶口，炼苗6～7 d后取出小苗，洗净根部培养基后移栽到自配基质中，30 d后统计成活率，再定植于大田。

2 结果与分析

2.1 不同浓度TDZ对芥蓝外植体不定芽再生的影响结果

2.2 不同基因型对芥蓝外植体不定芽再生的影响结果

在含0.50 mg/L TDZ的培养基中，不同基因型外植体不定芽的再生频率和再生系数见表2。由表2可见，J1子叶段的再生频率最低（73.49%），J2子叶段的再生频率最高（89.06%）；子叶段再生系数最高的是J3（3.63）。J2和J3真叶的再生频率间无显著差异，但两者与J1均有显著差异（P<0.05）；J2真叶再生系数最高（2.91），与J1有显著差异（P<0.05）。综合比较3种基因型外植体的再生频率和再生系数，J2（正源大笋黄花芥蓝）为不定芽诱导的最优基因型。

2.3 不同苗龄对芥蓝外植体不定芽再生的影响结果

2.4 不同浓度NAA对芥蓝外植体不定芽生根的影响结果

3 小结与讨论

本研究结果表明，TDZ既可以促进生根、又可促进形成愈伤组织，也可以直接再生不定芽，且浓度在0.05～1.00 mg/L范围内真叶有较好的再生效果。当TDZ浓度为0.50 mg/L，J2子叶段和真叶最高再生频率分别为89.06%和82.56%，与唐君等[11]下胚轴经0.50 mg/L TDZ浸泡30 min，放置于6-BA和NAA的激素组合的最高再生频率为98.50%，相差不到10.00%，满足后续试验的要求。本研究采用单一激素TDZ诱导芥蓝不定芽，试验适宜浓度范围广且易于操作，相对于前人研究方法简单，再生频率较高，再生芽数多，为芥蓝无性系离体诱变和转基因进行育种工作提供了一定的参考。

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