红曲霉的分离筛选

仓义超

（江苏省宿迁市产品质量监督检验所国家白酒检测中心，江苏 宿迁 223800）

红曲霉（Monascus purpureusWent.）中文别名红曲、红糟、红大米，散囊菌目中的一属子囊菌曲霉科真菌。存在于树木、土壤和堆积物等。在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成红色。红曲可用于酿酒、制醋、作豆腐乳的着色剂和调味剂，也可作中药。在酶制剂工业中也可用其生产糖化酶制剂。近年来，还发现红曲产生的活性物质具有降胆固醇、降血压以及预防和治疗其他疾病的功能。在白酒酿造方面，红曲霉因能产生多种功能性物质而得到了广泛的应用和研究。1991年，江苏双洋酒厂对本厂的大曲进行微生物分离时，分离出一株红曲霉，所分离的红曲霉具有极强的产酯能力，在生产应用中可以大幅提高大曲的糖化力、发酵力、液化力和酯化力。本文主要介绍一株优良红曲霉——M-1#的分离筛选及生产应用。

1 材料与方法

1.1 材料

清香大曲。

1.2 分离用培养基

麦芽汁培养基：12°Bx麦芽汁，2%琼脂，pH3.5～5.0。121℃灭菌20min。

1.3 分离方法

曲心和表皮各取5g，放入带有玻璃珠的90mL无菌水三角瓶中，摇床培养30min，此为10-1浓度菌液，吸取1mL至9mL无菌水中，此为10-2浓度菌液，依次稀释为10-3、10-4、10-5、10-6浓度菌液。分别吸取0.1mL各梯度浓度菌液至麦芽汁平板中涂布。35℃培养48h。

红曲霉的形态特征为菌丝体初期在粳米粒内部生长，无色，渐变为红色，并使米粒变成紫红色。菌丝体大量分枝，含橙紫红色颗粒，在分枝的顶端产生单个或成串的分生孢子，孢子呈球形或椭圆形，（6.5μm～10.5μm）×（7μm～9μm），闭囊壳橙红色，近球形，含有多数子囊，子囊内含8个孢子，直径25μm～75μm，子囊孢子卵形或近球形，光滑，透明，无色或漆红色，（5.5μm～6μm）×（3.5μm～5μm）。

挑取符合红曲霉形态特征的菌种分离纯化。

1.4 红曲霉的筛选方法

分离纯化得到3株红曲霉，转接在固体培养基35℃培养。培养48h。3株红曲霉分别编号为M-1#、M-2#、M-3#，并制成不同的固体麸曲。

1.4.1 产酯能力的测定

制备酯化液：取100mL 1%己酸乙醇溶液于250mL蒸馏烧瓶中，加入相当于5g干曲的曲量，在30℃～32℃保温酯化100h。然后加水50mL，加热蒸馏，接收蒸出液100mL，用化学分析法测定流出液中己酸乙酯含量。测定质含量：吸取50mL馏出液，用0.1mol/L氢氧化钠中和到酚酞终点。准确加入0.1mol/L氢氧化钠25mL，沸水浴中回流皂化30min。冷却后用0.05mol/L硫酸滴定到酚酞粉色消失为终点。

计算方法参考《白酒技术生产全书》酯化力及酯分解率测定方法。

1.4.2 糖化力的测定

制备曲子浸出液的糖化试液：称取5g干曲的曲粉，放在250mL烧杯中，加水（90-5×水分%）mL，缓冲液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min搅拌一次，然后用干滤纸过滤，弃去最初5mL，接收50mL澄清浸出液。准确吸取2%可溶性淀粉50mL与100mL容量瓶中，在35℃水浴中保温20min，准确加入酶浸出液10mL，摇匀并开始计时，在35℃水浴中准确保温1h。立即加入3mL 1mol/L的氢氧化钠，振荡，以停止反应。再冷却至室温，用蒸馏水定容至刻度。制作空白试验液：准确吸取2%可溶性淀粉溶液50mL于100mL容量瓶中。先加11mol/L氢氧化钠3mL，混合均匀后在加酶浸出液10mL，用蒸馏水定容，摇匀。

糖化液测定：准确吸取5mL糖化液于盛有斐林甲、乙液各5mL的150mL三角瓶中，加入适量0.1%标准葡萄糖溶液，摇匀，在电炉上加热至沸后，立即用标准糖液滴定至蓝色消失。空白液测定：以5mL空白液代替糖化液，其他操作同上。

计算方法参考《白酒技术生产全书》糖化酶活力测定方法。

1.4.3 闻香测试

将3株菌分别接于150mL液体麦芽汁培养基中35℃培养48h。10000r/min离心1min，留上清培养液闻香。

1.5 M-1#麸曲基酒生产

清香型白酒清蒸清茬工艺：破碎好的高粱（4、6、8瓣）用热水浸润24h，装甑清蒸90min，排除杂味，蒸完后取出摊晾，加入大曲粉等后，拌匀、入缸发酵，待酒醅发酵成熟（28d），添加适量辅料，拌匀、蒸酒，蒸馏得到的酒除去酒头和酒尾后分段存放，简称为普通基酒。

清蒸清茬红曲霉麸曲酒的生产工艺：选用M-1#菌种，扩培成M-1#固体麸曲。M-1#基酒与普通基酒工艺不同之处在于，加入大曲后，再加入适量的M-1#麸曲，拌匀，入缸发酵，其余均相同。蒸馏得到的酒除去酒头和酒尾后分段存放，简称为M-1#基酒。

1.6 化验M-1#基酒的色谱

1.7 对基M-1#酒进行品评

2 结果与分析

2.1 3株红曲霉酯化力测定结果

2.2 3株红曲霉糖化力测定结果

大曲中的3株红曲霉经过酯化力、糖化力测定后，菌株M-1#较为优秀。通过表1、表2可以看出，M-1#糖化力较高，达到1388.7U/g，酯化力为15.66mg/g，均为3株中最高值。

表1 红曲酯化力测定Table 1 Determination of esterifying power of Manascus

表2 红曲糖化力测定Table 2 Determination of saccharification power of Manascus

2.3 闻香测定结果

表3 红曲闻香数据Table 3 Analysis data of fragrant producing of Manascus

红曲霉经过液体培养后，通过闻香可以初步判断出其产香能力，通过闻香实验筛选出产香较好的菌种进行酿酒实验，以提高基酒质量。通过表3可以看出，M-1#在闻香上带果香，且香气浓郁。通过以上理化性能、闻香可以初步判断出M-1#为大曲中较为优秀的红曲霉。

2.4 M-1#基酒色谱结果

表4 两种不同工艺基酒气相色谱值Table 4 GC values of two different process base liquors

2.5 M-1#基酒品评结果

表5 两种不同工艺基酒品酒评语Table 5 Evaluation of two different process base liquors

2.6 分析

通过表4、表5可以看出，与普通基酒相比，M-1#基酒提高了基酒的乙酸乙酯，降低了乳酯含量，其余组分变化不大。在品评方面，同对照基酒相比，M-1#基酒入口显甜，酒体协调，余味较长，达到了改善酒质的目的。通过酿酒实验可以看出，从大曲中筛选出的M-1#在白酒酿造过程中达到了提高出酒率，改善酒质的目的，并且起到增乙降乳的作用。M-1#基酒在品评中表现为酯香正，突出，入口显甜，酒体协调，余味较长，尾味净。其中酯香突出也间接地对应上M-1#的闻香特点。

3 实验总结

本实验通过平板分离和生化性能测定方法筛选出一株综合性能优良的红曲霉菌株，详细介绍了酿酒生产中红曲霉的分离与筛选的全过程，可以作为今后酿酒生产中的指导。随着微生物技术的发展，越来越多的功能性微生物被用于白酒酿造生产过程中。而红曲霉作为我国应用较广的微生物，凭借其不俗的产香能力、糖化能力以及降乳能力，在近几年越来越多的应用到白酒酿造过程中。红曲霉的代谢产物主要是与白酒风味密切相关的一些酸醇类物质，并且可能具有稳定的代谢产物与代谢途径。红曲可以产生很多微量的风味物质，很可能是其提高酒质的原因。作为多种行业共同使用的功能菌，红曲霉通过其产香能力、糖化力、酯化力以及调节乙乳关系的能力充分的证明了在清香型白酒发酵中的作用，而通过红曲霉生产特色优质基酒也将是今后的方向。

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