陈醋生高粱糖化菌株的筛选

许云萧，郝 林*

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西太谷 030801）

传统陈醋的生产中，高温蒸煮工艺耗能约占整个生产总耗能的30%～40%左右[1]，大量燃煤不仅会造成能源的浪费，而且会引发环境污染。构成雾霾的三大成分——二氧化硫、氮氧化物和可吸入颗粒物均是燃煤锅炉排放的废气的成分，燃煤排放的烟尘中有许多无法去除的超细颗粒，是PM2.5一次细颗粒的主要来源。减少蒸煮工艺，在保证质量的同时实现节能减排是陈醋生产企业未来发展的一个方向，生料糖化技术因此应运而生。生淀粉的糖化不经过蒸煮糊化，而是通过生淀粉对糖化酶的吸附，糖化酶从淀粉的非还原性末端水解α-1，4葡萄糖苷键和α-1，6葡萄糖苷键得到还原糖，降解淀粉。本试验首先通过查阅相关资料选择产糖化酶较多的3种黑曲霉菌株，然后对3株菌株产酶条件进行优化，使菌株的产糖化酶的能力得到提高，最后从中筛选出最优的适宜生高粱糖化的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黑曲霉H303-4-3：山西农业大学食品科学与工程学院生物工程系保藏；黑曲霉AS.3324：中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心；黑曲霉cicc2137：中国食品发酵工业研究院。

1.1.2 主要仪器和设备

电子万用炉：天津市泰斯特仪器有限公司；雷磁pH-S数显pH计：上海精密科学仪器有限公司；仪表恒温水浴锅：上海树立仪器仪表有限公司。

1.1.3 主要试剂和药品

a）0.1mol/L乙酸—乙酸钠缓冲液（pH=4.6）：秤取6.7g乙酸钠，吸取冰醋酸2.6mL，用蒸馏水溶解定容至1000mL，然后以酸度计校正pH值。

b）0.05mol/L Na2SO3溶液：秤取硫代硫酸钠8g，加0.2g碳酸钠，煮沸10min，定容至1000mL，3d后用。

c）0.1mol/L I2液：5g碘化钾，水溶后加入2.54g碘，定容至100mL。

d）0.1mol/L NaOH溶液：5mL NaOH饱和溶液定容至1000mL。

e）2mol/L H2SO4：量取分析纯浓硫酸5.6mL，缓慢加入适量蒸馏水中，冷却后用蒸馏水定容至100mL。

f）20%NaOH。

g）2%可溶性淀粉溶液。

h）斜面培养基：PDA培养基。

i）初始麸曲培养基：15g麸皮，12mL水，自然pH值，混匀后润料1h。121℃高压灭菌30min，趁热打散。

j）麸皮、豆粕均为市售。

1.2 方法

1.2.1 麸曲的制作

在打散的麸皮培养基上接种三环试验菌种，8层纱布封口，30℃培养1d时摇瓶，2d时扣瓶培养。制成的麸曲要求内外底层菌生长均匀，无杂菌污染，无异味，有特殊的曲香，糖化发酵力强。

1.2.2 粗酶液的提取

秤取制作的干曲（换算成绝干曲5g），用约50mL乙酸—乙酸钠缓冲液（pH=4.6）在常温条件下搅拌浸泡1h后，用脱脂棉滤出浸出液，定容至50mL即为粗酶液。

1.2.3 糖化酶活力的测定及计算[2]

于甲、乙两只比色管中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25mL，0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液5mL。摇匀后在40℃水浴锅中预热5min，在甲管中加入酶液2mL，摇匀后计时反应1h后立即在2管中加入20%NaOH 0.2mL终止反应，冷水冷却后在乙管中加2mL酶液。取2管中上述反应液各5mL放入碘量瓶。加入0.1mol/L I2液10mL，0.1mol/L NaOH 15mL，放暗处15min，取出加H2SO42mL摇匀，用Na2SO3滴定至无色。

式中：X 为糖化酶活力（U/mL）；A 为空白消耗Na2SO3数（乙管）；B 为样品消耗Na2SO3数（甲管）；c 为Na2SO3物质的量浓度；90.05 为1mL 1mol/L Na2SO3相当葡萄糖的数；1/2 为折成1mL 酶液的量；32.2 为反应液总体积；5 为吸取反应液毫升数；n 为稀释倍数。

生淀粉糖化酶活力的测定：在40℃、pH=4.6条件下，1g干麸曲1h降解生淀粉释放1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位[2]。测定方法同糖化酶活力的测定，将可溶性淀粉改为生淀粉。

1.2.4 生淀粉对酶液吸附率的测定[2]

1g生淀粉用5倍的粗酶液在40℃、pH=3.6的柠檬酸缓冲液中振荡搅拌15min，离心分离，取上清液测定淀粉酶活力A，测粗酶液酶活力B，计算吸附率AB：

1.2.5 麸曲的感官及理化分析[3]

a.水分测定

准确称取待测的麸曲5g，放入事先烘干，恒重的培养皿中，在115℃烘箱中烘至恒重，加盖在干燥器中冷却30min，称重。

式中：m0为空培养皿质量（g）；m 为空培养皿加试样质量（g）；m1为空培养皿加烘干后试样质量（g）。

b.糖化酶活力测定

同1.2.3 糖化酶活力定义：1.0g酶粉于40℃、pH4.6条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g表示。

c.酶活力保存率测定

根据测出的麸曲的最高酶活力与每天测酶活的比值，可以算出试样麸曲酶活力的保存力。

式中：X 为样品酶活力保存率（%）；E1为样品实测酶活力（U/g）；E 为样品最高酶活力（U/g）。

d.麸曲的感官评定

从麸曲内外层菌丝分布是否均匀，颜色是否一致，是否含有杂物，有无结块现象，气味几个方面来判断。

2 结果与分析

2.1 AS.3324菌株产糖化酶条件的优化

在预试验中，对AS.3324菌株的初始产糖化酶条件进行了确定，经过试验得出在麸曲培养基装瓶量为20g，接种3环孢子，30℃的条件下培养4d，AS.3324的产糖化酶能力最强。在此基础上，进行以下条件的优化[4-8]。

2.1.1 菌龄对酶活的影响

在上述条件下，接种不同生长时间的菌株于培养基，测其糖化力，结果见表1。在菌株培养到第3d时接种，AS.3324的糖化力最强。此时孢子刚由黄色变为黑色，糖化酶的活力强。

表1 菌龄对酶活的影响Table 1 Effect of fungus age on enzyme activity

2.1.2 麸皮与水分比例对酶活的影响

在2.1.1的条件下，改变麸皮与水分的配比，测糖化酶的活力，结果见表2。在麸皮与水分的比例为15∶12时，AS.3324产糖化酶的活力最强。通过观察麸曲的表面、横断面和底面，在水分含量较少的情况下，孢子分布不均匀，表层和底层孢子较多，呈该菌成熟的黑色，内层孢子生长较少，麸曲质量较差。在水分含量多的情况下，麸皮培养基不易打散，黏度较大，含氧量下降，不利于菌株的生长，在后期的存放过程中，容易被其他菌污染。

表2 麸皮与水分比例对酶活的影响Table 2 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

2.1.3 pH值对酶活的影响

在2.1.2的试验基础上，于不同的初始pH值条件下培养AS.3324，测定糖化酶活力，结果见表3。由表3看出，在pH值为5时，AS.3324的糖化酶活力最强。

表3 pH 值对酶活的影响Table 3 Effect of pH value on enzyme activity

2.1.4 麸皮∶豆粕对酶活的影响

在2.1.3 的试验结果下，将AS.3324接种在不同碳源和氮源的培养基上，结果见表4。在麸皮和豆粕的比例为3∶2时，菌株的糖化酶活力最高。麸皮来源广泛，价格低廉，而且含有丰富的氮及其他微生物生长的必需营养物质，有利于糖化酶的产生。所以在单独使用麸皮作为培养基时，菌株的糖化力也很高。在陈醋的生产过程中，麸皮还作为醋的辅料。

表4 麸皮∶豆粕对酶活的影响Table 4 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

综上，在麸皮与豆粕的比例为3∶2，麸皮与水分的比例为15∶12，pH值为5，装瓶量为20g的条件下，接种培养3d的菌株，30℃培养4d，AS.3324 的糖化酶活力最 高，达2044.23U/g。

根据上述方法，分别再对cicc2137、H303-4-3的产糖化酶条件进行优化。

2.2 cicc2137菌株产糖化酶条件的优化

在预试验中确定了菌株cicc2137的初始产糖化酶条件，即在麸曲培养基装瓶量为20g，接种3环孢子，30℃的条件下培养3d，cicc2137的糖化酶活力最强。在此基础上，进行以下条件的优化。

2.2.1 菌龄对酶活的影响

在上述试验结果下，接种不同培养时间的cicc2137，结果如下：在麸皮培养基上，接种培养3d的菌株得到的麸曲培养基的糖化力最强。

表5 菌龄对酶活的影响Table 5 Effect of fungus age on enzyme activity

2.2.2 麸皮与水分比例对酶活的影响

根据2.2.1的试验结果，在不同的麸皮与水分比例下接种菌株，结果见表6。在麸皮∶水=15∶13时，cicc2137的酶活力高达2450.17U/g。

2.2.3 pH值对酶活的影响

表6 麸皮与水分比例对酶活的影响Table 6 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表7 pH 值对酶活的影响Table 7 Effect of pH value on enzyme activity

在2.2.2的条件下，选取不同的pH值进行菌株的培养。结果见表7。在pH值为4时，菌株糖化酶酶活力最高。但cicc2137对pH值的变化较敏感，不利于醋生产中的应用。

2.2.4 碳氮比对酶活的影响

在2.2.3的试验基础上，在不同的麸皮与豆粕比条件下培养cicc2137，结果见表8。在C∶N为4∶1时，菌株的糖化力最强。

表8 C∶N 对酶活的影响Table 8 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

综上，在麸皮与豆粕的比例为4∶1，麸皮与水分的比例为15∶13，pH值为4，装瓶量为20g的条件下，接种培养3d的菌株，30℃培养3d，cicc2137 的糖化酶活力最高，达2624.14U/g。

2.3 H303-4-3菌株产糖化酶条件的优化

在预试验中，对H303-4-3菌株的初始产糖化酶条件进行了确定，经过试验确定在麸曲培养基装瓶量为15g，接种3环孢子，30℃的条件下培养4d，H303-4-3的产糖化酶能力最强。在此基础上，进行以下条件的优化：

2.3.1 菌龄对酶活的影响

在上述的试验结果下，将培养不同时间的H303-4-3接种在麸皮培养基上，结果见表9。H303-4-3生长到第4d接种时，糖化酶活力最高。

表9 菌龄对酶活的影响Table 9 Effect of fungus age on enzyme activity

2.3.2 麸皮与水分比例对酶活的影响

根据2.3.1的试验结果，将菌株接种在不同麸皮与水分比例的培养基上测其糖化力。结果表明，在麸皮∶水分的比例为15∶10的时候，H303-4-3的糖化力最强。

2.3.3 pH值对酶活的影响

在2.3.2的结果下，将菌株接种在不同pH值的培养基上，试验结果见表10。在pH值为5时，菌株的酶活力达2551.66U/g。

表10 麸皮与水分比例对酶活的影响Table 10 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表11 pH 值对酶活的影响Table 11 Effect of pH value on enzyme activity

2.3.4 碳氮比对酶活的影响

依据2.3.3的试验结果，将H303-4-3接种在不同比例碳源和氮源的培养基上，结果见表12。在麸皮和豆粕的比例为4∶1时，菌株的糖化酶活力最高。

表12 C∶N 对酶活的影响Table 12 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

综上，在麸皮与豆粕的比例为4∶1，麸皮与水分的比例为15∶10，pH值为5，装瓶量为15g的条件下，接种培养4d的菌株，30℃培养4d，H303-4-3的糖化酶活力最高，达2783.63U/g。

2.4 所选菌株与生产用大曲的各项指标比较

对市售生产陈醋用的红心大曲、后火大曲和清渣大曲[3]的糖化力进行测定，并对3种大曲及所选3种菌株的生淀粉糖化力、吸附率进行测定，结果见附图。所选菌株黑曲霉H303-4-3、AS.3324、cicc2137的酶活、生淀粉糖化力、吸附率均高于市售陈醋大曲，AS.3324的糖化酶活力低于cicc2137，对生淀粉的糖化力较强，但其酶活力随菌株生长的时间下降过快，不利于生产中的应用；cicc2137虽酶活较高，但其生淀粉糖化力、吸附率都比较低，这不利于生料酿醋工艺；H303-4-3的各项指标最优，最适宜，耐酸性较好，且对生淀粉的糖化力、吸附率都明显高于生产用大曲，对H303-4-3进行感官和理化指标的测定，其糖化酶活力为2798.12U/g，3个月后酶活力保存率≥86%，水分含量≤10%，内外菌体生长一致，颜色为浅褐色，无结块，无酸、霉等异味，无杂质，为麸曲特殊的清香。所以H303-4-3可以作为陈醋生高粱糖化的优选菌株。

附图 3种大曲及所选3个菌株的酶活、生淀粉糖化力、生淀粉对酶的吸附率Attached Fig.Three kinds of daqu and the selected three strains of enzyme activity,starch saccharifying power and crude starch on enzyme adsorption rate

3 结论

本试验通过对所选3个菌株产糖化酶的条件进行优化，得到了每个菌株的最优产酶条件。经过优化后H303-4-3菌株的糖化酶活力最高：在麸皮与豆粕的比例为4∶1，麸皮与水分的比例为15∶10，pH值为5，装瓶量为15g的条件下，接种培养4d的菌株，30℃培养4d，H303-4-3的糖化酶活力达2783.63U/g。通过各项指标与陈醋大曲进行比较，最终确定黑曲霉H303-4-3作为陈醋生高粱糖化的菌株。若将所筛选出的菌株制成大曲强化剂，加入到传统制醋生产大曲中，可以在保留传统陈醋生产工艺的同时，使陈醋生产向生料糖化转变，在保证陈醋品质的前提下实现企业的节能减排。

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