肝素对家兔心肺复苏后炎性因子的影响研究

王白永，孙仁华，屈百鸣，郭振军

心肺复苏(CPR)是对心搏骤停患者采取的维持人工循环和通气的关键技术和方法，及时、有效的CPR可明显提高患者的生存率[1]。CPR后随着自主循环的建立会出现再灌注损伤，其程度影响着CPR患者的预后[2]。缺血再灌注损伤是一个包括中性粒细胞活化、多种因子及黏附分子过度表达、伴有多种炎性递质及信号传导分子参加的复杂过程。研究发现，肝素可通过多种机制或途径起到抗炎作用[3]，并对炎症级联反应中的多种炎性递质有抑制作用。本研究的目的即观察肝素对家兔CPR后核转录因子κB (NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康实验用新西兰家兔40只，雌雄各半，体质量2.0～2.5 kg，由杭州医学科学院提供，动物合格证号2009SCXK(浙)2009-0039。饲养于清洁环境中，自由饮水，12 h光照。采用随机数字表法分3组：正常对照组8只；肝素组16只，给予肝素钠200 U/kg；0.9%氯化钠溶液组16只，给予0.9%氯化钠溶液2 ml/kg。

1.2 手术操作 术前12 h禁食不禁水，20%乌拉坦3 ml/kg经兔耳缘静脉缓慢推注，麻醉成功后，背部固定于家兔试验手术台，用动物皮肤电极连接标准导联进行心电监护，常规消毒皮肤，沿颈正中线纵行切开皮肤、气管，置入小儿气管导管，吸入氧气3 L/min，缝合局部皮肤，分离右侧股动脉，缓慢置入动静脉留置针，监测血压。

1.3 诱发心室纤颤和CPR[4]肝素组和0.9%氯化钠溶液组采用家兔体表贴膜法电刺激诱导心室纤颤，在胸壁心尖搏动点和右锁骨下分别粘贴贴膜，接通100 V交流电，连续放电6 s后，观察心电图和动脉压力波形，必要时重复直至出现心室纤颤波形，平均动脉压<20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，心室纤颤5 min后，按分组给予肝素钠200 U/kg或等量0.9%氯化钠溶液，用除颤仪接贴膜60 J除颤1次，并接小动物呼吸机辅助通气,容控模式，潮气量10 ml/kg，呼吸频率45 次/min，吸入氧浓度100%，并于胸外心脏按压，频率180 次/min，按压深度为胸廓前后径的1/3，耳缘静脉推注肾上腺素20 μg/kg，除颤不超过3次，所有上述操作均在3 min内完成。CPR成功标准为心电图出现窦性心律，平均动脉压稳定在60 mm Hg以上，并维持5 min为自主循环恢复，记录CPR时间及自主呼吸恢复时间，自主呼吸恢复后停止机械通气，继续通过气管导管吸氧(流量3 L/min)。CPR成功动物在CPR后按既定时间点持续观察，在此期间不给予其他药物。CPR 5 min未恢复自主循环者，为CPR失败，停止抢救。

1.4 血流动力学数据采集 分别于造模前、CPR成功即刻(T0)、CPR成功后1 min(T1)、30 min(T2)、60 min(T3),记录心率、平均动脉压。

1.5 心室肌标本采集 空白对照组气管插管，股动脉置管后处死家兔，肝素组和0.9%氯化钠溶液组分别于CPR成功后1 h处死家兔取左心室心肌厚3 mm，采用免疫组织化学方法(北京康为世纪生物科技有限公司)测定心肌NF-κB活化情况[5]。

1.6 免疫组织化学结果的判定 显微镜观察并予以表达量高低评分。NF-κB阳性定位于心肌细胞核及细胞质内，阳性呈黄色或黄褐色。计分标准，参考Arai等[6]的计分标准，按着色细胞染色强度及面积计分：基本不着色者为0分，着色淡者为1分，着色适中者为2分，着色深者为3分；着色细胞占计数细胞的百分率≤5%记0分，6%～25%记1分，26%～50%记2分，≥51%记3分。将每张切片的染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，>6分为强阳性(+++)。将表达(-/+)划为低表达组，(++～+++)划为高表达组。

1.7 心肌TNF-α含量测定 空白对照组、肝素组和0.9%氯化钠溶液组处死家兔，取心肌称重，加入液氮手工研磨，磨成粉末后加入一定量磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.4)使标本匀浆化，2 000～3 000 r/min，离心半径13.5 cm，4 ℃低温离心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱。严格按试剂盒操作用酶联免疫吸附剂法(ELISA)测心肌TNF-α含量。

2 结果

2.1 3组心室纤颤前体质量、心率、平均动脉压比较 3组心室纤颤前体质量、心率、平均动脉压比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.2 肝素组与0.9%氯化钠溶液组CPR效果比较 电击致颤后，肝素组与0.9%氯化钠溶液组均出现心室纤颤，各组均死亡1只，标准体外CPR后，肝素组自主循环恢复时间较0.9%氯化钠溶液组缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；两组自主呼吸恢复时间及CPR成功率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.3 肝素组与0.9%氯化钠溶液组CPR后心率和平均动脉压变化比较 肝素组与0.9%氯化钠溶液组CPR后不同时间点心率和平均动脉压比较，差异均有统计学意义(心率：F组间=66.54，F时间=88.80，P<0.001；平均动脉压：F组间=101.86，F时间=2.36，P<0.001,见表3)。

表1 实验前各组家兔基本生理指标情况

表2 肝素组与0.9%氯化钠溶液组CPR效果比较

Table2 Comparison of the efficacy of CPR between the heparin group and the sodium chloride solution group

组别只数自主循环恢复时间(s)自主呼吸恢复时间(s)CPR成功率肝素组15100±10370±10314/1509%氯化钠溶液组15157±23420±1219/15检验统计量值-865∗-127∗466P值<001 022 008

注：*为t值，余检验统计量值为χ2值；CPR=心肺复苏

2.4 CPR后心肌NF-κB表达情况 光镜下可见正常对照组心肌细胞内有散在颗粒状棕黄色沉淀物，其NF-κB为低水平表达(见图1A)；肝素组可见胞内有较多点颗粒及条索状棕黄色沉淀，其NF-κB为低水平表达(见图1B)；0.9%氯化钠溶液组可见细胞核内及胞质遍布颗粒及条索状棕褐色沉淀物，NF-κB呈高水平表达(见图1C)。3组NF-κB表达情况比较，差异有统计学意义(u=43.00，P<0.05)；其中肝素组和0.9%氯化钠溶液组NF-κB高表达率较正常对照组升高，0.9%氯化钠溶液组较肝素组升高，差异均有统计学意义(P<0.05，见表4)。

表4 家兔CPR后心肌NF-κB表达情况(只)

2.5 CPR后心肌TNF-α含量比较 CPR 1 h后心肌TNF-α含量正常对照组为(126±23)pg/ml，肝素组为(221±36)pg/ml，0.9%氯化钠溶液组为(300±29)pg/ml，3组比较差异有统计学意义(F=135.21，P<0.01)；0.9%氯化钠溶液组较肝素组升高，差异有统计学意义(q=-8.11，P<0.01)。

2.6 NF-κB的表达量与TNF-α含量的相关性 经Spearman相关分析，NF-κB的表达量与TNF-α含量呈正相关(r=0.801，P<0.01，见图2)。

3 讨论

在CPR发展的50年过程中，尽管已逐渐提高了CPR的成功率，但其预后一直是一个重大难题。其机制与缺血-再灌注、缺氧、应激等一系列病理生理改变有关。国外研究发现，肝素可阻止由于缺血再灌注引起的心肌损伤[7]。家兔体表贴膜法电刺激诱导心室纤颤，不需开胸，避免开胸直接刺激家兔心脏以及对其他组织器官的影响，造模简便、易于操作[8]，为家兔心搏骤停模型的常用方法。本研究在该模型基础上，给予肝素钠或等量0.9%氯化钠溶液，之后进行CPR，比较各组CPR成功率及NF-κB、TNF-α的表达水平。结果发现，肝素用于电击所致的家兔心室纤颤后，与0.9%氯化钠溶液组比较，可使家兔自主循环恢复时间缩短，心率和平均动脉压升高，NF-κB、TNF-α的表达水平降低；CPR成功率虽有一定的提高，但二者比较无差异，可能与实验动物数量有关。

表3 肝素组与0.9%氯化钠溶液组CPR后不同时间点心率和平均动脉压变化比较

注：A：正常对照组，B：肝素组，C：0.9%氯化钠溶液组

图1 家兔CPR后心肌NF-κB的免疫组织化学结果(DAB染色，×200)

Figure1 The immunohistochemical results of NF-κB in the rabbits′ myocardium after CPR

图2 家兔CPR后心肌NF-κB表达量与TNF-α含量的相关性

Figure2 The correlation between the expression of NF-κB and the level of TNF-α in the rabbits′ myocardium after CPR

研究发现，肝素除具有抗凝血、抗血栓、抗炎、免疫调节、调节多肽生长因子、抑制细胞增殖、抗肿瘤转移等多种生物学活性和药理作用之外[7]，还具有阻抑白细胞黏附活化，抑制补体的激活，保护血管内皮细胞免受趋化因子、组胺、细菌内毒素及氧自由基等损伤以及维持内皮细胞完整性等作用，这可能与肝素分子中存在多种可与黏附分子、细胞因子、补体等炎性递质、内皮细胞等结合的活性或受体部位以及聚糖结构有关。Yao等[9]和Li等[10]在Wistar大鼠离体心脏缺血再灌注模型中发现肝素可以抑制TNF-α的合成及缺血期离体心脏TNF-α的释放，从而可以阻止由于缺血再灌注心肌损伤引起的左室功能低下。此外，近年来对心肌缺血再灌注损伤的研究表明，NF-κB转录产生的细胞因子TNF-α可激活血液及全身组织炎症细胞引起炎症的“瀑布效应”，并直接引起血管内皮细胞和心肌细胞的损伤[9]，甚至引起多脏器功能衰竭。因此，改善CPR后血流动力学，同时抑制心肌NF-κB的活化、减少TNF-α的释放对改善CPR后患者的预后有着重要的意义。本研究发现肝素用于经皮电击致心室纤颤的家兔后，可以使家兔心肌NF-κB表达量降低、TNF-α含量减少，使家兔自主循环恢复时间缩短。其机制可能与肝素能较快改善家兔CPR后血流动力学，同时抑制心肌NF-κB的活化，使TNF-α的释放减少，减轻缺血再灌注心肌损伤有关。本研究存在一定的不足，没有设置不同浓度的肝素实验组；且实验动物数量不足，造模后各组动物只数不一致，使得量效关系和CPR成功率的分析上仍有欠缺。

本研究提示临床CPR中给予肝素治疗，将有可能提高CPR的成功率，同时改善患者预后，但同时还要注意肝素应用可能导致的出血等并发症。因此，其临床应用中还有待进一步研究。

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