慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血组蛋白去乙酰化酶2的表达及临床意义

2013-04-19叶瑞海张鸣华慈晓上官宗校林海赵仁国许建华

浙江医学 2013年10期

叶瑞海张鸣华慈晓上官宗校林海赵仁国许建华

●诊治分析

叶瑞海张鸣华慈晓上官宗校林海赵仁国许建华

目的探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期患者外周血组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2, HDAC2）的表达及其与C反应蛋白（CRP）、降钙原素（PCT）的关系。方法选择67例COPD急性加重期患者，根据病情分为轻、中、重度3组，均行肺功能检查。选择同期体检中心20例健康体检者为对照组。ELISA双抗体夹心法测定HDAC2表达水平，免疫比浊法测定炎症蛋白CRP、PCT浓度。结果随着病情的加重，外周血炎症蛋白CRP、PCT浓度显著升高，而HDAC2浓度呈逐渐下降趋势，各组间的差异均有统计学意义（均P＜0．01）。HDAC2表达水平和炎症蛋白PCT浓度呈负相关（P＜0．05）。结论HDAC2可能是COPD急性加重期患者炎症反应的负调控因子。

慢性阻塞性肺疾病组蛋白去乙酰化酶类降钙素原 C反应蛋白

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的呼吸系统疾病，是一种具有气流受限特征的可防可治疾病，其气流受限呈不完全可逆、进行性发展，与肺脏对吸入烟草、烟雾等有害气体或颗粒的异常炎症反应有关[1]。基因的表达和染色体的重构密切相关，组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）通过乙酰化修饰组蛋白分子末端赖氨酸残基,使染色质的结构松散，出现解链效应，基因序列向转录启动复合物开放，启动特定基因的转录过程，而组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）能够抑制基因的表达[2-3]。大多数的真核细胞均可表达类HDAC，但不同的细胞表达不同的HDAC。目前认为组蛋白脱乙酰基酶2（HDAC2）是一个重要的参与基因转录活性调节的核酶，通过对组蛋白乙酰化和去乙酰化水平的双向调节，增加组蛋白去乙酰化水平,稳定染色体结构，阻断转录因子与DNA的结合,从而下调炎症基因的转录和表达，调节炎症反应[4]。笔者通过测定COPD急性加重期患者外周血HDAC2的表达以及C反应蛋白（CRP）、降钙原素（PCT）浓度，探讨3者间的关系。

1 对象和方法

1.1 对象选择2010-06—2012-04在我院就诊的67例COPD急性加重期患者，其中男43例，女24例，年龄42～83岁，平均（68±12）岁。所有患者均符合2007年中华医学会呼吸病学分会制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》标准[1]，并根据严重程度分为3组，轻度COPD组21例，男11例，女10例，年龄46～83岁，平均（64±10）岁；中度COPD组22例，男11例，女11例，年龄48～78岁，平均（66±14）岁；重度COPD组24例，男13例，女11例，年龄42～76岁，平均（63±12）岁。所有入选对象均行肺功能检查。排除标准：（1）支气管哮喘；（2）有严重心、肝、肾功能不全及恶性肿瘤；（3）有吸烟史或戒烟少于1年。选择同期健康体检中心20例健康体验者为对照组，男12例，女8例，年龄38～78岁，平均（64±12）岁。各组患者性别、年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 ELISA酶联免疫分析试剂盒（购自美国R&D公司，DRE12200、DRE10045、DRE10203），酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS公司352型），洗板机（芬兰Thermo Labsystems公司AC8型），微量高速离心机（国产TG16W型）,隔水式恒温培养箱（国产GNP-9080型）。

1.3 方法抽取外周血6ml，立即加入有EDTA抗凝剂试管，混合10～20min后，离心20min（2 000～3 000r/min）。收集上清液，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。血浆置于-80℃冷冻冰箱，待ELISA检测。ELISA检测步骤：应用双抗体夹心法测定标本中人HDAC2水平；使用免疫比浊法测定炎症蛋白CRP、PCT浓度。操作方法按ELISA试剂盒说明书提供的方法严格执行，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品浓度。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H检验。相关性分析采用Spearman秩相关。

2 结果

2.1 4组患者外周血炎症蛋白CRP和PCT浓度的比较见表1。

由表1可见，随COPD急性加重期患者病情加重，外周血炎症蛋白CRP和PCT水平均明显升高，各组间的差异均有统计学意义（均P＜0.01）；进一步两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.2 4组患者外周血HDAC2浓度比较见表2。

由表2可见，随着病情的加重，HDAC2水平逐渐下降。与对照组比较，轻、中、重度COPD组患者外周血HDAC2水平明显下降，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。2.3 轻、中、重度COPD组患者外周血HDAC2表达水平和CRP、PCT的相关性轻、中、重度COPD组外周血HDAC2表达水平与PCT表达呈负相关（r=-0.236、-0.258、-0.314，均P＜0.05），其与CRP水平无明显相关（r=-0.145、-0.173、-0.167，均P＞0.05）。

表1 4组患者外周血炎症蛋白CRP和PCT浓度的比较

表2 4组间外周血HDAC2水平比较

3 讨论

目前已知组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）共有17个亚型,大致分属Ⅰ类和Ⅱ类2个不同种属的核酶家族。Ⅰ类HDACs主要存在于细胞核内,包括1、2、3和8等4个亚型,Ⅱ类则包括4、5、6、7、9和10等6个亚型。HDAC2在皮质类固醇治疗中起着举足轻重的作用，能减少类固醇激素治疗的不敏感性，并通过使组蛋白分子末端第5个赖氨酸残基脱乙酰基作用使之带正电荷,因此分子与组蛋白的结合变得更为紧密,阻断了转录复合物与特定序列的结合。相反，HAT通过乙酰化修饰组蛋白分子末端赖氨酸残基,使染色质的结构变松散,出现解链效应，基因序列向转录启动复合物开放,启动特定基因的转录过程[2]。Ito等[5]检测来自COPD患者的肺组织标本和肺泡灌洗液巨噬细胞，发现随着COPD病情的加重，肺组织和巨噬细胞HDAC2活性下降，HDAC mRNA表达和酶合成降低，说明HDAC活性水平与COPD病情严重程度存在显著的负相关。本研究发现，随着COPD患者病情加重，HDAC2表达水平逐渐降低，且与PCT呈负相关。

PCT是无激素活性的降钙素前肽物质，由116个氨基酸组成，分子量为13KD的糖蛋白[6]，可选择性地对系统性细菌、真菌及寄生虫感染发生反应，而对无菌性炎症和病毒感染无反应或仅有轻度反应。有研究发现，全身性细菌、真菌和寄生虫感染时，PCT水平异常增高，增高的程度与感染的严重程度及预后相关[7-8]。CRP是由于能与肺炎球菌荚膜的C2多糖物质发生沉淀反应而得名[9]。PCT和CRP均为机体炎症反应敏感指标，但PCT不受机体免疫状态影响，其浓度升高程度和感染严重程度呈正相关,具有敏感性高，特异性好的特点。

本研究对轻、中、重度COPD组和对照组比较，发现随着病情的加重，炎症指标明显升高，且各组间的差异均有统计学意义（均P＜0.01），说明随着COPD病情加重，其炎症反应持续增强，炎症介质的增多和炎症反应自我增强、放大，最终造成COPD患者气管炎症长期持续和进行加重，与Rahman等[10]研究结果一致。

HDAC2表达水平随着COPD患者病情的加重而逐渐下降，与PCT呈负相关，提示其可能是COPD患者炎症反应的负调控因子。因此对外周血HDAC2表达水平的监测有助于对COPD疾病严重程度的判断，对临床病情分析及基因位点干预治疗具有重要意义。

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Histone deacetylase 2 levels in peripheral blood of patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease

ObjectiveTo investigate histone deacetylase 2 (HDAC2)levels in peripheral blood of patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．MethodsSixty-seven patients with COPD in acute exacerbation were enrolled in the study．Lung function tests were performed to evaluate disease severity and patients were classified as mild, moderate and severe groups．Twenty healthy subjects served as controls．The HDAC2 levels were measured by ELISA．The inflammatory proteins C-reactive protein (CRP)and procalcitonin (PCT)were measured by immunoturbidimetric assay．ResultsThe CRP and PCT levels were increased in COPD patients as compared to healthy controls．The HDAC2 levels in mild,moderate and severe groups were 6．93±1．25,6．42±1．46 and 3．79±1．12,respectively(P＜0．01)．HDAC2 level was negatively correlated with inflammatory protein PCT(P＜0．05)．ConclusionHDAC2 levels are decreased in peripheral blood of COPD patients and correlated with the severity of disease,indicating that it may be a negative regulator of inflammatory response in patients with COPD．

Chronic obstructive pulmonary disease Histone deacetylase Procalcitonin C-reactive protein