mir-183在食管鳞癌组织中的表达及其与患者预后的关系

2013-04-19彭兵锋凌志强罗君袁嘉敏郑志国毛伟敏

浙江医学 2013年10期

彭兵锋凌志强罗君袁嘉敏郑志国毛伟敏

彭兵锋凌志强罗君袁嘉敏郑志国毛伟敏

目的探讨原发性食管鳞癌（ESCC）组织中mir-183的表达及其与患者临床病理特征、基因表达及预后之间的关系。方法检测83例ESCC组织及癌旁正常组织中mir-183以及基因的表达状况，并对患者的临床病理特征及预后进行分析。结果 83例标本中mir-183表达上调51例（61．4%），mir-183表达的上调与ESCC患者的淋巴结转移、拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）表达及不良预后有关（均P＜0．05）。结论 mir-183的表达上调与ESCC的淋巴结转移及TopoⅡ的表达状况有关，并提示预后不良。

mir-183 食管鳞癌淋巴结转移拓扑异构酶Ⅱ 预后

食管癌是常见的恶性肿瘤之一。目前，对于食管癌的早期诊断及治疗较以往已取得巨大进步，但术后生存率仍不容乐观，其发生、发展的机制仍有待进一步研究和探讨[1]。近年来，关于microRNAs（miRNAs）的研究被广泛关注，其在肿瘤中的作用机制也成为科研热点。miRNAs是新近发现的一组天然丰富的小RNA，长度约17～25个核苷酸，新近研究表明miRNAs属于表观遗传学的范畴[2-3]。miRNAs在肿瘤的演变过程中的作用类与癌基因或抑癌基因相似[4-6]。mir-183是miRNAs家族的一员，有研究指出，mir-183的异常表达与肿瘤发生、发展有关[7-8]。但是，有关mir-183的异常表达在原发性食管鳞癌（ESCC）的演变过程中的作用及其机制尚有待研究。在中国，食管癌的主要病理类型是ESCC，食管腺癌主要发生于西方国家[9]。本文通过检测ESCC组织及相应癌旁正常组织中mir-183的表达状况，探讨原发性ESCC患者组织中mir-183的表达状况及其与食管癌临床病理特征及预后之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料选择2009-07—2010-09浙江省肿瘤医院食管癌手术后组织标本及相应癌旁正常组织，患者术前均未接受化疗或放疗83例。其中男72例，女11例，年龄41～74岁（≥60岁36例，＜60岁47例）；高/中分化64例，低分化19例；上/中段病变35例，下段病变48例；Ⅰ/Ⅱ期34例，Ⅲ/Ⅳ期49例；伴有淋巴结转移52例，无淋巴结转移31例。癌旁正常组织取自肿瘤边缘5cm外区域，为肉眼下正常组织，上述组织切除后，快速用液氮冷冻并储存于-80℃冰箱中用作RNA提取。全部肿瘤组织均经病理诊断为鳞状细胞癌，肿瘤分级、TNM分期分别按照2009年国际抗癌联盟的标准。对该83例患者术后进行随访，随访时间截至2011-10-15。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 RNA提取试剂盒MiRNeasy Mini Kit购于德国Qiagen公司，琼脂糖、0.5%TBE液、EB液、反转录试剂盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real time RT-PCR试剂盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）购于日本TaKaRa公司。引物由上海Invitrogen公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：mir-183：5′-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3′，对照组U6：5′-CGCTTCGGCAGCACA TATAC-3′，下游通用引物由反转录试剂盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Ki（tD350A）提供。按照MiRNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取ESCC组织及其癌旁组织的总RNA，紫外分光光度计测量，判定所取总RNA的浓度和纯度，要求光密度值A260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液与1.5%的变性琼脂糖凝胶中进行电泳，测定所提RNA的完整性。

1.2.2 逆转录取1μg总RNA使用PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA的合成，具体操作参照使用说明。

1.2.3 PCR扩增 Real time RT-PCR的PCR扩增及溶解曲线分析均使用ABI 7500PCR仪（Applied Biosystems），采用20μl的反应体系，具体操作参照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ的使用说明。反应过程具体为：50℃激活聚合酶2min，95℃预变性1min；95℃变性5s，60℃退火和延伸34s，扩增40个循环。结束后通过95℃15s，60℃1min，85℃15s，60℃15s制作溶解曲线。应用实时RTPCR方法及2-ΔΔCT法对检测出的ESCC患者癌组织及癌旁正常组织中mir-183的表达状况进行分析（表达上调：ΔΔCT＜-1，表达下调：ΔΔCT＞1，正常表达：-1＜ΔΔCT＜1）。

1.3 统计学处理采用SPSS17.0统计软件，不同临床病理特征和基因表达情况者之间的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，生存曲线用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，对数秩检验进行生存曲线比较，多因素分析采用Cox比例风险模型。

2 结果

2.1 mir-183在ESCC组织中的表达 mir-183表达下调8例，表达正常24例，表达上调51例。

2.2 mir-183表达上调与ESCC的临床病理特征及基因表达的关系见表1、2。

由表1可见，mir-183的表达上调与ESCC的淋巴结转移有关（P＜0.05），而与年龄、性别、分化程度、肿瘤位置、肿瘤浸润、远处转移、TNM分期无关（均P＞0.05）。由表2可见，mir-183的表达上调与TopoⅡ的表达状况差异有统计学意义（P＜0.05），而与p53、CerbB-2、MRP的表达状况无关（P＞0.05）。

表1 mir-183的表达上调与ESCC的临床病理特征的关系

表2 mir-183的表达上调与基因表达的关系

2.3 mir-183表达上调与患者预后的关系在51例mir-183表达上调的ESCC患者中复发、转移及死亡总数为42例（82.4%），而32例非表达上调的ESCC患者中复发、转移及死亡总数为15（46.9%），提示mir-183的表达上调与ESCC的不良预后相关（图1）。Cox模型回归多因素分析结果显示，mir-183的表达上调与区域淋巴结转移、远处转移及ToPoⅡ的表达一起作为ESCC患者预后的影响因子（P＜0.05，表3）。

图1 mir-183的表达上调与ESCC患者在生存率的生存曲线

表3 mir-183的高表达与临床病理特征的COX多因素分析

3 讨论

本实验采用real time RT-PCR方法检测了83例原发ESCC组织及相应的癌旁正常组织中mir-183的表达水平，并用2-ΔΔCT法测定83例ESCC组织及癌旁组织中mir-183的表达差异，结果说明mir-183在癌组织中的表达较癌旁正常组织为高[10-13]。

在与临床病理特征关系的统计学分析中发现，有淋巴结转移的ESCC标本中mir-183的表达上调率明显高于无淋巴结转移组，说明mir-183表达上调与ESCC中淋巴结转移相关[12-14]，另外，在与基因的表达状况的统计分析中发现，TopoⅡ阳性的ESCC组织中mir-183的表达上调率也较TopoⅡ阴性为高。说明mir-183表达上调与ESCC中TopoⅡ的表达相关[15-16]。在mir-183的表达上调与ESCC患者预后的相关性方面，我们对患者术后生存时间进行随访，并采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线、对数秩检验进行生存曲线比较，分析mir-183的表达上调与ESCC患者预后之间的关系。结果显示，到2011-10随访截止时，mir-183表达上调组的ESCC患者的病死率高于非表达上调组，mir-183表达上调组的ESCC患者的中位生存时间明显比非表达上调组短。ESCC患者预后的Cox模型回归多因素分析结果显示，mir-183的表达上调与淋巴结转移、远处转移及TopoⅡ的表达一起作为ESCC患者预后的影响因素（P＜0.05）。因此，本研究结果证实了mir-183的表达上调可能是ESCC患者的一个预后不良因子[8，13]。

总之，mir-183的表达上调在ESCC中是一个频发事件，mir-183的表达上调与ESCC患者的淋巴结转移、TopoⅡ表达相关，并提示不良预后。因此，mir-183可能是ESCC的预后因子之一。有关mir-183的表达上调与在ESCC中的作用机制的研究尚处于起步阶段，mir-183在ESCC发生、发展过程中的作用及其机制还有待深入研究和探讨，这将会为ESCC患者的预后评估提供更多理论指导。

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Expression of microRNA-183 in esophageal squamous cell carcinoma and its correlation with disease prognosis

Objective To investigate the expression of microRNA-183(mir-183)in esophageal squamous-cell carcinoma（ESCC）and its correlation with disease prognosis．MethodsThe expression of mir-183 was detected by real-time RT-PCR and immunohistochemistry in 83 ESCC tissue specimens and corresponding pericancerous tissues．ResultsAmong 83 ESCC samples mir-183 was significantly up-regulated(2～6411-fold)in 51 cases compared to the matching pericancerous tissues．Up-regulation of mir-183 expression was correlated with lymph node metastasis,expression of ToPoⅡand poor prognosis in ESCC patients(all P＜0．05)．ConclusionUp-regulation of mir-183 expression may indicate the poor prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma．

Mir-183 ESCC Lymph node metastasis TopoⅡ Prognosis