阿托伐他汀对COPD大鼠转化生长因子β1及胶原表达的干预作用

王建岗 刘进

阿托伐他汀对COPD大鼠转化生长因子β1及胶原表达的干预作用

王建岗 刘进

目的 观察慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠支气管肺组织转化生长因子（TGF）-β1和胶原表达的变化特点以及两者相关的关系，探讨阿托伐他汀对支气管肺组织TGF-β1和胶原表达的干预作用。 方法 将雄性SD大鼠分成3组（健康对照组、COPD模型组和阿托伐他汀干预组），10周后用小动物肺功能仪测定气道阻力（RL）和动态顺应性（Cdyn）；观察各组大鼠支气管肺组织的病理特征；测定支气管肺组织的胶原表达率和TGF-β1含量。比较各组支气管肺组织TGF-β1含量，支气管肺组织中胶原的表达率，以及两者相关性。 结果 （1）COPD模型组基本符合人类COPD病理生理变化。外周细支气管平滑肌层和细胞外基质胶原较健康对照组大鼠明显增多。阿托伐他汀干预组与COPD模型组比较，RL减少（P＜0．01），Cdyn增加（P＜0．01）。（2）COPD模型组TGF-β1蛋白（5．66±0．35）μg·L-1，较阿托伐他汀干预组（3．25±0．69）μg·L-1升高明显（P＜0．01），健康对照组（1．62±0．46）μg· L-1，与另两组相比降低明显（均P＜0．01）。（3）COPD模型组支气管肺组织胶原表达率为（17．18±5．34）%，较健康对照组[（7．42± 2．97）%]增高（P＜0．01），阿托伐他汀干预组为（11．94±4．03）%，较健康对照组升高（P＜0．05），但较COPD模型组降低（P＜0．01）。（4）各组支气管肺组织TGF-β1含量与胶原表达率呈显著正相关（r=0．802，P＜0．01）。 结论 （1）慢性烟薰和气道内滴入LPS能构建含有气道重构特征的C0PD大鼠模型。（2）支气管肺组织胶原沉积增多是COPD气道重构的重要病理变化。胶原表达率与TGF-β1呈正相关，表明TGF-β1在COPD气道重构中起重要作用。（3）早期应用阿托伐他汀可明显抑制气道TGF-β1的表达，影响COPD大鼠气道重构的发生、发展。

慢性阻塞性肺疾病 转化生长因子-β1 胶原 阿托伐他汀

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of atorvastatin on the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1)and collagen in rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．MethodsMale SD rats were divided into three groups;control group,COPD model group and atorvastatin intervention group．After 10 weeks，airway resistance(RL) and dynamic compliance(Cdyn)was measured;the pathological features of lung tissue of three groups were observed;the expressions of TGF-β1 and collagen content in bronchial and lung tissue were measured．ResultsIn COPD model the peripheral bronchiolar smooth muscle layer and collagen in extracellular matrix increased significantly compared to the healthy control group．In intervention group RL reduced(P＜0．01)and Cdyn increased(P＜0．01)compared to model group．The expressions of TGF-β1 of COPD model group was 5．66±0．35/μg·L-1,which was significantly higher than that in intervention group(3．25± 0．69/μg·L-1,P＜0．01)and healthy control group (1．62±0．46/μg·L-1,P＜0．01)．The expression of collagen of bronchial and pulmonary tissue in COPD group was(17．18±5．34)%,which was higher than that in healthy group (7．42±2．97%,P＜0．01),the expression of collagen of intervention group was(11．94±4．03)%,which was higher than that in healthy group(P＜0．05)and lower than that in COPD group (P＜0．01)．The expression of TGF-β1 was positively correlated with collagen expression in bronchial and pulmonary tissue (r=0．802,P＜0．01)．ConclusionThe increased collagen deposition in bronchial and pulmonary tissue is an important pathological changes of COPD airway remodeling,which is associated with up-regulation of TGF-β1 expression．Early administration of atorvastatin can significantly inhibit TGF-β1 expression and interfere in the development of COPD rat airway remodeling．

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种危害人类健康的常见病，预计到2020年COPD将成为世界上引起死亡的第三大病因[1]。它以气道慢性炎症和肺泡结构破坏为特征，吸烟是其最主要的危险因素。然而，肺泡进行性破坏的确切机制目前尚不清楚，此外，并非所有的吸烟者都发展为COPD，且戒烟后数年这种病理过程仍持续存在[2-3]，其具体原因不明。目前大多数学者倾向于认同在香烟烟雾慢性刺激下遗传易感者出现持续的气道炎症导致气道重构是COPD发生和发展的主因。我们通过COPD大鼠模型的制备，观察大鼠支气管肺组织中转化生长因子（TGF）-β1和胶原的表达水平和给予阿托伐他汀干预后的变化，探讨COPD气道重构机制及他汀类药物在COPD气道重构的发病过程中所发挥的保护性作用。

1 材料和方法

1.1 动物的分组及处理 二级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠25只(浙江省医学科学院动物中心提供)，体重（200±20）g，采用随机数字表法，分为3组。（1）健康对照组（n=7）：为空白对照。（2）COPD模型组（n=9）：分别于第1、28天在大鼠气管内注入浓度为lg/L的细菌内毒素（LPS）溶液200μl（购自美国Sigma公司）1次。余周一～五，在自制薰烟箱中，每天薰大前门牌香烟（每支含焦油23mg，尼古丁1.5mg）2次，每次20支薰30min；周六、日上午薰烟1次，共10周。（3）阿托伐他汀干预组（n=9）：每只大鼠于第15天起每天薰烟前胃管注入阿托伐他汀（商品名：立普妥，美国辉瑞公司生产，批号1237022）10mg/kg，余处理同COPD模型组。

1.2 动物肺功能的测定[4]上述各组大鼠于第71天，称取体重，用25%乌拉坦4ml/kg腹腔注射麻醉，自制气管插管，连接气道并固定，然后在右前胸第4～5肋间胸腔插管，放入密闭容积描记箱，MedLab生物信号记录分析系统导出潮气量、气道流速、跨肺压，观察30s，计算气道阻力（RI，跨肺压/气道流速）、动态肺顺应性（Cdyn，潮气量/跨肺压），计算第0.3s用力呼气容积与用力呼气容积的百分比（FEV0.3/FVC）。

1.3 病理标本制作及TGF-β1、胶原表达的测定 3组动物均经股动脉放血处死。剪开胸腔结扎右主支气管，取右下叶部分肺组织留作电镜标本，2.5%戊二醛固定，1%的锇酸后固定，常规脱水，树脂透入包埋，超薄切片，电镜观察；余右肺组织迅速置入液氮速冻，保存在-70℃冰箱。左肺10%的中性甲醛溶液25cmH2O水压下灌注固定20min，再浸入甲醛溶液固定，常规脱水，透明，浸蜡包埋，作HE染色，Masson三色染色。ELISA试剂盒检测TGF-β1含量；Masson三色染色法检测胶原表达率。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件，计量资料均以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni和Tamhane法，相关性检验采用Pearson直线相关分析。

2 结果

2.1 一般情况 COPD模型组大鼠渐出现饮食、活动减少，平均体重较正常组减轻，后期可见毛发干枯、发黄，呼吸频率加快，可听到喘息音；阿托伐他汀干预组症状较模型组轻；正常组均未见以上情况出现。

2.2 3组大鼠肺功能比较 见表1。

表1 3组大鼠肺功能比较

由表1可见，造模完成后进行肺功能测定，COPD模型组大鼠FEV0.3/FVC、Cdyn较对照组均明显降低，RL较对照组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01），说明小气道阻力增加，存在明显气流受限、阻塞性肺通气功能障碍；阿托伐他汀干预组FEV0.3/FVC、Cdyn均较COPD模型组升高，RL较COPD模型组降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.3 3组大鼠细支气管管壁HE染色、Masson染色病理 见图1、2。

由图1、2可见，正常对照组可见气管黏膜纤毛柱状上皮细胞完整，纤毛排列整齐，气管及各级支气管见少量杯状细胞，仅见少量炎细胞浸润，气道结构未见异常，周围血管壁未见炎症细胞浸润，肺泡大小正常，结构完整，少量炎细胞浸润。

COPD模型组气道黏膜上皮层增厚，杯状细胞增生，黏膜下腺体增生肥大，支气管管周大量炎症细胞浸润，少量红细胞渗出，气道壁增厚，上皮下纤维化，胶原沉积，平滑肌增生和肥大，肌成纤维细胞增殖。气道发生不完全阻塞，肺泡扩张，肺泡间隔破坏，肺泡纤维化及上皮细胞增生，结构发生显著改变。阿托伐他汀干预组部分支气管黏膜上皮细胞轻度变性、少量坏死及脱落，未见杯状细胞的明显增多，各级支气管壁有少量炎性细胞浸润，未见管腔内有黏液栓形成，中层平滑肌稍增厚；未见明显的肺疱腔扩大及肺大疱的形成。

图1 3组大鼠细支气管管壁HE染色病理观察（A：健康对照组；B：COPD模型组；C：阿托伐他汀干预组；×100）

2.4 支气管肺组织Masson染色胶原表达率和TGF-β1含量比较 见表2。

表2 支气管肺组织Masson染色胶原表达率和TGF-β1含量比较

由表2可见，COPD模型组支气管肺组织胶原表达率较健康对照组增高（P＜0.01），阿托伐他汀干预组较COPD模型组降低（P＜0.01），但仍较健康对照组增高（P＜0.05）；COPD模型组支气管肺组织TGF-β1含量较健康对照组增高（P＜0.01）；阿托伐他汀干预组为较COPD模型组降低（P＜0.01）；但仍较健康对照组增高（P＜0.05）。

2.5 Masson染色胶原表达率与TGF-β1含量相关性分析 支气管肺组织Masson染色胶原表达率与TGF-β1蛋白含量呈显著正相关（r=0.802，P＜0.01）。

3 讨论

COPD是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，其患病率和病死率仍居高不下。目前认为气道炎症和重构在COPD的发病过程中起重要作用。本实验在先前建立的大鼠COPD模型基础上参考文献[5]，适当延长烟熏时间。结果表明，本模型组大鼠支气管肺组织病理形态和病理生理符合人类慢性支气管炎及阻塞性肺气肿的特点，即气道阻力增加，顺应性下降，外周气道平滑肌增厚，细胞外基质胶原明显增多。

气道重构是COPD气流受限难以逆转的病理变化基础，它引起的气道不可逆狭窄和持续气道高反应性，是COPD反复急性加重和进展的病理基础[6]。近些年气道重构的研究越来越受到人们的关注，在COPD疾病的早期即可发生气道重构的改变。气道重构一旦形成，即很难逆转，因此早期对气道重构的病理过程进行干预，对COPD的预后具有重要意义。以胶原为主的细胞外基质过度沉积是COPD气道重构的重要病理改变，也是COPD气流阻塞的重要原因。

细胞外基质过度沉积是气道重构的主要病理改变[7]。胶原是肺细胞外基质蛋白的主要成分，分布在肺间质支气管与血管周围。在急性肺损伤早期已经启动胶原合成[8]。另外，胶原积聚是肺纤维化的一个重要特征，在纤维化晚期以Ⅰ型胶原增多为主，而在早期及活跃阶段则表现为Ⅲ型胶原增多[9]。我们通过Masson染色半定量方法测定支气管肺组织胶原含量，结果显示模型组大鼠支气管肺组织胶原较健康对照组明显升高，说明COPD存在细胞外基质重构的特性。气道壁胶原增多引起管腔狭窄，气道阻力增加，并使平滑肌收缩效应成倍增加；肺实质胶原增多造成肺气肿和肺纤维化并存，使气道和肺的可塑性下降，弹性阻力增加，从而影响肺的通气和换气功能，最终导致呼吸衰竭。

TGF-β1是一种多效性细胞因子，诱导纤维细胞增生，胶原纤维及细胞外基质合成增多、抑制胶原的降解等参与气道结构的重构[10]，是不可逆气流受限的主要原因。吸烟的COPD患者小气道TGF-β1蛋白和mRNA的表达明显升高，且与小气道的阻塞呈正相关。宋一平等[11]最近研究发现，在COPD模型小鼠中TGF-β1在支气管黏膜上皮，肺小动脉内皮和肺泡巨噬细胞的表达显著增加，且TGF-β1的量与支气管平滑肌厚度，胶原厚度呈正相关。牛瑞超等[12]的研究进一步证实，TGF-β1可以通过Smads信号通路抑制COPD支气管上皮细胞SLPI的表达和分泌，导致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，形成肺气肿气道重构的病理生理变化。

本实验结果表明，COPD模型组大鼠TGF-β1在支气管黏膜上皮、肺小动脉内皮和肺泡巨噬细胞的表达显著增强，且其表达与胶原呈正相关，说明其参与了COPD气道重构过程。

他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，是已经广泛应用于临床的降脂药物，其多效性备受关注。近年来研究发现，他汀类药物除了降脂作用外还有抗炎、抗氧化、改善内皮功能、调节免疫等作用[13-14]。他汀类药物能够抑制多种炎症因子的表达和降低许多血清炎症标志物，对炎症反应过程的各阶段都有抑制作用。吴尚洁等[15]通过体外实验发现，阿托伐他汀能降低由LPS诱导的肺上皮细胞分泌的炎症因子前列腺素E2（PGE2）和IL-6的浓度。

本实验结果显示，阿托伐他汀干预组与COPD模型组比较，实验大鼠气道阻力明显降低，肺顺应性增加，TGF-β1含量及Masson染色胶原表达率的水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，阿托伐他汀对COPD的气道炎症特别是气道重构有一定的抑制作用，其可能的机制主要是对各种炎症细胞和炎症介质的抑制。对IL-1的抑制可直接减少TGF-β1的表达；对IL-6的抑制可直接减轻气道炎症反应，减少IL-17分泌，降低Th17细胞水平；对金属蛋白酶的抑制可减轻气道炎症反应和肺泡结构的破坏，进而缓解COPD的进展。

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Intervention of atorvastatin on transforming growth factor-β1 and collagen in COPD rat models

Chronic obstructive pulmonary disease Transforming growth factor-β1 Collagen Atorvastatin

2012-10-11）

（本文编辑：沈昱平）

310009 杭州，浙江大学医学院附属第二医院感染性疾病科（王建岗为在职研究生，现在杭州市急救中心工作）