Snail、E-cadherin和MMP-2在I型子宫内膜癌中的表达及临床意义

2013-04-19潘洪琳冯振中

浙江医学 2013年10期

潘洪琳冯振中

潘洪琳冯振中

目的探讨子宫内膜样腺癌组织中转录因子Snail、上皮钙黏附素（E-cadherin）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达关系，研究Snail促进子宫内膜癌侵袭转移的机制及临床意义。方法采用免疫组化方法，结合组织芯片技术，检测58例I型子宫内膜癌、17例内膜不典型增生、21例正常内膜组织中Snail、E-cadherin和MMP-2的表达水平，分析3种蛋白表达之间的相关性及与临床病理因素的关系。结果Ⅰ型子宫内膜癌组织中存在Snail和MMP-2蛋白的过度表达以及E-cadherin蛋白的低度表达（P＜0．01）。Snail蛋白表达与FIGO分期、淋巴结转移相关（P＜0．05），E-cadherin表达的降低与肿瘤肌层浸润和淋巴结转移相关（P＜0．05），MMP-2蛋白表达与肿瘤淋巴结转移显著相关（P＜0．01）。子宫内膜样腺癌组织中Snail和E-cadherin的表达存在负相关关系（r=-0．259,P＜0．05），而Snail蛋白与MMP-2的表达呈显著正相关（r=0．447,P＜0．01）。结论 Snail可能通过调节E-cadherin和MMP-2蛋白的异常表达促进子宫内膜样腺癌的侵袭转移，联合检测Snail、E-cadherin和MMP-2对于判断子宫内膜样腺癌的恶性潜能和生物学行为具有重要意义。

子宫内膜癌转录因子Snail上皮钙黏附素基质金属蛋白酶2 组织芯片

侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的生物学特征之一。上皮-间质转化（EMT）是指在特定生理或病理条件下，具有极性的上皮细胞转化为具有间质细胞特性的改变过程，并与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关[1-2]。锌指蛋白转录因子Snail作为EMT现象中的关键调控因子，可通过下调上皮钙黏附素（E-cadherin）的表达而降低细胞的黏附力，也可通过上调基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达而增加肿瘤细胞的侵袭力[3]，促进肿瘤的转移。有关子宫内膜癌组织中Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白表达失调鲜见报道，故本实验采用免疫组化方法，结合组织芯片技术，初步探讨Snail、E-cadherin和MMP-2的表达在子宫内膜癌发生、侵袭和转移中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料收集2003-01—2011-01浙江省绍兴第二医院妇产科经诊断性刮宫、宫腔镜检查和手术切除的子宫内膜组织石蜡标本96例，其中子宫内膜样腺癌患者58例，子宫内膜不典型增生17例（复杂性不典型增生16例，单纯性不典型增生1例），正常子宫内膜21例（增生期9例，分泌期12例）。子宫内膜样腺癌患者年龄36～76（56.8±8.6）岁。据2000年FIGO标准，手术病理分期为Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期20例。根据2003年WHO标准，分为高分化27例，中分化23例，低分化8例。肌层浸润＞50%24例，≤50%34例。淋巴结转移者15例，无转移43例。子宫内膜不典型增生年龄30～66（51.0±10.2）岁。正常子宫内膜者年龄23～52（36.5±8.4）岁。子宫内膜样腺癌患者、子宫内膜不典型增生者及正常子宫内膜者年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。所有患者术前均未接受放疗、化疗。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及组织芯片兔抗人多克隆Snail抗体购自Santa cruz生物公司（工作浓度1∶120），鼠抗人单克隆E-cadherin抗体（工作浓度1∶200）、鼠抗人单克隆MMP-2抗体（工作浓度1∶60）、Elivision Plus试剂盒以及DAB显色液均购自福州迈新生物技术有限公司。选择所需病例存档蜡块，光学显微镜下根据HE切片进行形态学观察，确定具有代表性的病变部位并标记，参照文献手工制备组织芯片[4]。

1.2.2 实验步骤应用Elivision Plus二步法对Snail、E-cadherin和MMP-2进行免疫组化染色。实验步骤严格按照说明书操作。PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性切片作为阳性对照。

1.2.3 结果判断染色结果采用双盲法，由2位经验丰富的病理科医师独立阅片、计数。（1）Snail蛋白主要定位于细胞核，阳性标准[5]：①阳性细胞率≤5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，＞75%计为4分；②染色强度：无色计为0分，浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。为方便数据统计，将Snail标本分为阴性表达组（两者乘积＜2分）及阳性表达组（两者乘积≥2分）。（2）E-cadherin蛋白主要定位于细胞膜，染色分级标准[6]：以正常内膜组织E-cadherin表达为阳性对照，肿瘤细胞无染色或阳性细胞率≤10%计为0分，低度染色且阳性细胞数≥10%计为1分，中度染色且阳性细胞数≥10%计为2分，癌细胞染色和正常组织相同者为强度染色，且阳性细胞数≥10%计为3分。将0～2分者均定为E-cadherin表达降低，3分者定为E-cadherin表达正常。（3）MMP-2蛋白主要定位于细胞质，阳性标准判断方法同Snail蛋白[5]，统计学分析将MMP-2标本分为阴性表达组（两者乘积＜2分）及阳性表达组（两者乘积≥2分）。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件。计数资料率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，相关关系采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在不同内膜组织中的表达见表1、图1。

表1 Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在不同内膜组织中的表达（例）

图1 Snail、E-cadherin和MMP-2在子宫内膜组织中的表达[A: Snail在子宫内膜样腺癌中阳性表达；B:E-cadherin在子宫内膜样腺癌中缺失表达；C:E-cadherin在正常内膜组织中阳性表达；D: MMP-2在子宫内膜样腺癌中阳性表达（×200）]

由表1可见，Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达率分别为55.2%（32/58）、25.9%（15/58）、51.7%（30/58），较不典型增生和正常内膜组织显著改变，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 Snail、E-cadherin和MMP-2表达与子宫内膜样腺癌临床病理指标的关系见表2。

由表2可见，Ⅰ型子宫内膜癌中Snail的阳性表达与FIGO分期和淋巴结转移相关，差异有统计学意义（P＜0.05），但与其他临床病理指标差异无统计学意义（P＞0.05）。E-cadherin蛋白与肌层浸润和淋巴结转移相关，差异均有统计学意义（均P＜0.05），MMP-2蛋白与淋巴结转移相关，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

表2 Snail、E-cadherin和MMP-2表达与子宫内膜样腺癌临床病理指标的关系（例）

2.3 子宫内膜样腺癌中Snail、E-cadherin和MMP-2表达的的相关性见表3。

表3 子宫内膜样腺癌中Snail、E-cadherin和MMP-2表达的相关性（例）

3 讨论

锌指转录因子Snail基因定位于人第20号染色体20q12.3，基因全长5 882bp，包含3个外显子，编码含264个氨基酸的蛋白质，由一个含有4～6个Cys-His（C2H2）型锌指结构域的高度保守的羧基末端和一个高度可变的氨基末端构成。早期研究认为在胚胎发育中，Snail基因参与中胚层和神经嵴的发育及形态形成运动，在诱导细胞移动及组织塑形中起重要作用。最近研究报道，在多种人类恶性肿瘤中Snail存在过度表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关。本组实验中，Snail蛋白在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率为55.2%（32/58），明显高于不典型增生和正常内膜组织，并且随着手术病理分期的增加、淋巴结转移的出现，Snail阳性表达也明显升高，提示Snail参与子宫内膜癌的发生、发展过程，过度表达与肿瘤的恶性程度、侵袭转移等生物学行为关系密切，这与其他文献报道一致。Yin等[7]研究报道Snail蛋白在36%的胰腺癌中过度表达，并与患者淋巴结转移和远处转移明显相关，体外稳定转染Snail质粒至Panc-1胰腺癌细胞株，并采用不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶或吉西他滨处理转染Panc-1细胞，结果发现肿瘤细胞不仅侵袭能力显著提高，而且化疗耐药性也明显增强，裸鼠原位种植结果发现，转染肿瘤细胞株的体内转移率明显上升。

E-cadherin是普遍存在于人体各种组织细胞中，通过介导同型细胞连接，在维持正常上皮细胞形态、细胞极性和组织结构完整性中发挥重要作用。E-cadherin启动子区域存两个相邻的E-box结构，内含有一致的5′-CAGGTG序列，Snail基因以锌指区域识别并结合E-box序列，直接抑制E-cadherin的表达和功能，从而促进EMT发生。Yokoyama等[8]构建了E-cadherin表达阳性的（HOC719-PE）和表达阴性的（HOC719-NE）的口腔鳞癌细胞克隆，结果发现 E-cadherin阳性的HOC719-PE形态呈典型的上皮细胞样，肿瘤侵袭能力较低，不表达 Snail基因；而 E-cadherin阴性的HOC719-NE细胞形态呈间质成纤维细胞改变，肿瘤侵袭能力明显升高，强烈表达Snail基因。Yoshida等[9]对95例上皮性卵巢癌的研究中发现，随着良性卵巢上皮到交界性肿瘤到卵巢癌的恶变过程，Snail蛋白的表达逐渐升高，而E-cadherin的表达水平不断降低和缺失，并且Snail阳性表达患者生存时间明显减少，Snail是独立的临床预后判断指标。本实验结果也显示，32例Snail阳性的子宫内膜癌标本中，有84.4%（27/32）E-cadherin异常表达，而26例Snail阴性的组织，仅有61.5%（16/26）E-cadherin蛋白异常，随着Snail表达的升高，E-cadherin蛋白表达明显降低，两者的表达呈负性关系（r=-0.259，P=0.049），且与肿瘤的淋巴结转移明显相关。结合上述文献，我们认为，E-cadherin可能是Snail直接作用的靶基因，在子宫内膜癌侵袭和转移的过程中发挥着重要作用。

Snail作为EMT过程的中心作用因子，不仅与E-cadherin的异常表达有关，还可能通过调节其他下游靶基因而发挥作用。MMP-2是一种锌离子依赖性的蛋白水解酶，能够降解多种细胞外基质和基底膜成分，促进肿瘤细胞突破组织学屏障，形成邻近组织的侵袭和远处转移。但目前Snail和MMP-2在肿瘤中的作用和功能研究较少，相互关系尚不明确。本实验结果发现，MMP-2的表达从正常内膜组织到不典型增生再到子宫内膜癌的演变过程中不断递增（P＜0.01），在累及盆腔淋巴结标本中，阳性表达明显增加，而Snail蛋白在子宫内膜癌恶性演变过程中也逐渐递增，与MMP-2的升高趋势一致，两者在子宫内膜样腺癌中呈显著的正相关（r= 0.447，P＜0.01）。Jin等[10]采用基因芯片技术分析反义序列沉默Snail后的卵巢癌细胞株，结果发现MMP-2的表达和活性也随之降低，在体内原位种植实验中，Snail基因沉默组的MMP-2蛋白表达显著抑制，而肿瘤大小和远处转移病灶明显减少。以上结果说明，Snail可能是MMP-2重要的上游调控因子，Snail能够调节MMP-2的表达和活性并提高肿瘤的浸润转移能力。

综上所述，Snail作为EMT过程中的关键调控因素，一方面通过抑制E-cadherin的表达，减少肿瘤细胞间的黏附作用和接触抑制，另一方面也可以刺激MMP-2的分泌，降解肿瘤周围基质，有利于肿瘤细胞的脱落和侵袭，通过多种途径、多个环节在子宫内膜癌的侵袭和转移中发挥重要作用。因此，联合检测Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白的异常表达，有助于子宫内膜癌恶性程度及临床预后的判断，以Snail为靶点的治疗可能成为子宫内膜癌的重要治疗手段之一。

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Expression of Snail,E-cadherin and MMP-2 in type I endometrial carcinoma and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Snail,E-cadherin and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in patients with type I endometrial carcinoma and its clinicopathological significance．MethodsTissue microarray and immunohistochemical staining were performed to evaluate Snail,E-cadherin,and MMP-2 expression in 58 cases of endometrial carcinoma, 17 cases of atypical hyperplasia and 21normal endometrial samples．The correlation between these three markers with clinicopathological features were examined．ResultsThe expression of Snail,E-cadherin and MMP-2 proteins was significantly changed as lesions progressed from normal endometrium through atypical hyperplasia to carcinoma,(P＜0．01)．In addition,increased expression of Snail was tightly associated with FIGO stage and lymph node metastasis．Down-regulated expression of E-cadherin protein showed a significantly correlation with myometrial invasion and lymph node metastasis(P＜0．05)．Similarly, MMP-2 protein also correlated with lymph node metastasis(P＜0．05)．In primary endometrioid adenocarcinoma,there was a significant negative association of Snail with E-cadherin expression(r=-0．259,P=0．049),while the expression of Snail was positively correlated with MMP-2(r=0．447,P＜0．01)．ConclusionSnail and MMP-2 expression is up-regulated and E-cadherin expression down-regulated in endometrial carcinoma,and detection of these three markers may predict the potential malignancy and tumor behavior．

Endometrial cancerSnailE-cadherin MMP-2 Tissue microarray