原因不明性复发性流产淋巴细胞免疫治疗的剂量及疗效研究

2013-04-18王海燕吴晓云李晓荣魏丽娜邱惠麒朱国战周媛萍

浙江医学 2013年20期

王海燕吴晓云李晓荣魏丽娜邱惠麒朱国战周媛萍

王海燕吴晓云李晓荣魏丽娜邱惠麒朱国战周媛萍

目的探讨原因不明性复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）患者再次妊娠结局及治疗前后患者外周血调节性T细胞水平的变化。方法对165例URSA患者进行主动免疫治疗，观察患者治疗后再次妊娠结局。同时检测和分析治疗前后患者外周血的CD4+CD25+Tr水平。将试验过程中供体血浆析出较少致使分离得到的淋巴细胞较少的患者37例作为低剂量组，较多者84例作为高剂量组。结果 165例患者中，再次妊娠121例，仍在治疗中44例。再次妊娠的患者中成功分娩87例，再次发生早期流产14例，继续妊娠20例，主动免疫治疗成功率88．5%。其中低剂量组成功分娩29例，再次早期流产8例，主动免疫治疗成功率（72．4%）显著低于高剂量组（92．3%），差异有统计学意义（P＜0．05）。所有患者治疗后CD4+CD25brightT表达水平均显著高于治疗前（P＜0．05）；妊娠成功患者外周血CD4+CD25+Tr及CD4+CD25brightT均较妊娠失败者显著升高（P＜0．05）。结论主动免疫治疗对URSA患者有效，治疗时应注射高剂量淋巴细胞，主动免疫治疗可显著提高患者CD4+CD25brightT的表达水平，CD4+CD25brightT可能是调控母胎界面局部免疫耐受形成的一个重要因素。

原因不明性复发性流产 CD4+CD25+T细胞淋巴细胞免疫治疗

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）系指2次及2次以上的自然流产。RSA的流产多发生于同一妊娠月份，是妇产科常见病。RSA的病因复杂，除了遗传、内分泌、解剖、微生物感染等传统病因外，仍有很多病因未明确。原因未明的称之为原因不明性复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。近代生殖免疫的研究认为，妊娠是一种半同种移植现象，妊娠成功依赖于母胎之间的免疫耐受关系。URSA多系同种免疫异常，导致母胎免疫耐受关系被打破，而CD4+CD25+Tr对免疫耐受具有调节作用，可能在母胎免疫耐受中起着重要的作用，其平衡的失调可能会影响妊娠结局[1]。目前国内外通常采用患者配偶或第三方淋巴细胞对URSA患者进行主动免疫治疗。本文探讨对URSA患者进行主动免疫治疗的效果及CD4+CD25+Tr细胞与URSA的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 2008-03—2011-03我院生殖中心收治的确诊为URSA患者165例，年龄24～38（30.5±3.5）岁。所有患者均具备以下条件：（1）流产次数≈2次，均为早期流产（孕周＜12周）；（2）夫妻染色体检查正常；内分泌检查、TORCH检查均正常，无生殖道畸形、母儿血型不和因素；免疫各项检查如抗心磷脂抗体、抗核抗体及封闭抗体均阴性；（3）配偶男科相应检查均正常。

1.2 方法

1.2.1 主动免疫治疗抽取患者配偶或第三方个体静脉血20ml（肝炎病毒学、梅毒抗体、艾滋病抗体均正常）2%肝素抗凝取血浆，置入预先加有淋巴细胞分离液的离心管中（淋巴细胞分离液比重1.020，法国Biowest公司生产），注意淋巴细胞分离液和血浆之间界面保持清晰。以250g/min离心15min，取淋巴细胞层，磷酸盐缓冲液洗涤2次后用0.9%氯化钠溶液制成淋巴细胞悬液，取0.5～0.8ml悬液于患者双侧前臂各分4～6点皮内注射。治疗间隔3～4周，3次为1个疗程，治疗期间注意避孕，于1个疗程结束后鼓励患者在6个月内妊娠，6个月后若未怀孕再进行下1个疗程治疗。如获妊娠则每4周加强免疫1次至12～20周，随访至分娩。主动免疫治疗前和第1个疗程结束后2周、临床妊娠成功后（孕周＞12周）以及再次早期流产后分别抽取患者外周血2ml进行流式细胞检测。将试验过程中供体血浆析出较少致使分离得到的淋巴细胞较少的患者37例作为低剂量组，将供体血浆析出较多，从而分离得到的淋巴细胞亦较多的患者84例作为高剂量组。

1.2.2 流式细胞术检测调节性T细胞采用Ficoll法分离出外周血单个核细胞，将收集的淋巴细胞浓度调整至（10～20）×106/ml；取100μl放入流式管，加入CD4-FITC（Cat Num 555432）、CD25-PE（CatNum 555346）抗体各5μl；再取100μl放入另一流式管，加入FITC-IgG（CatNum 555432）和PE-IgG（Cat Num 555346）各5μl作为阴性对照，最后上机检测（以上试剂均为美国BD PharMingen公司生产）。

1.3 统计学处理采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，治疗前后及组间比较采用t检验。计数资料以频数与百分率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 主动免疫治疗后的再次妊娠结局 165例患者中，再次妊娠121例，仍在治疗中44例。再次妊娠的121例患者中成功分娩87例，继续妊娠20例，再次发生早期流产14例，主动免疫治疗成功率达88.5%（107/121）。

2.2 治疗前后患者外周血调节性T细胞水平变化见表1。

表1 治疗前后URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表达水平比较（%）

由表1可见，主动免疫治疗后患者外周血CD4+CD25brightT表达频率较治疗前显著升高，CD4+CD25dimT表达频率治疗前后无明显变化。

2.3 不同剂量的淋巴细胞对URSA患者治疗效果低剂量的淋巴细胞主动免疫治疗URSA患者妊娠成功29例，妊娠失败8例，再次妊娠成功率为72.4%（29/37），显著低于高剂量组妊娠率92.3%（78/84），差异有统计学意义（χ2=5.26，P＜0.05）。

2.4 治疗后不同妊娠结局的URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表达水平比较见表2。

表2 治疗后不同妊娠结局的URSA患者外周血CD4+CD25+Tr表达水平比较（%）

3 讨论

现代生殖免疫学认为妊娠是一种半同种移植过程，妊娠成功维系依赖于母胎之间所呈现出的免疫耐受状态。正常的妊娠过程涉及到诸多因素之间的平衡，其中任何一个环节出现异常，都有可能打破机体的免疫耐受，导致妊娠失败[2]。

近年来研究发现，CD4+CD25+Tr是机体以主动的方式获得和维持自身耐受的一种重要方式。人类的CD4+CD25+Tr可分为CD4+CD25brightT和CD4+CD25dimT两个细胞亚群[3]，其中CD4+CD25brightT主要表现免疫抑制和免疫无能两个主要特性，CD4+CD25dimT与机体的免疫耐受无关。

已有众多报道表明URSA患者外周血和蜕膜组织中Tr数量和功能明显低于正常妊娠妇女，使得母体对胎儿免疫抑制作用减弱，胚胎遭受免疫攻击而发生流产[4-5]。目前国内外通常采用配偶或第三方淋巴细胞对URSA患者进行主动免疫治疗，其目的是诱导妊娠母体对胎儿的免疫耐受，避免母体免疫系统对胎儿的攻击，从而使得妊娠过程得以顺利进行。杨卉等[8-9]发现URSA患者正常早孕妇女外周血CD4+CD25+Tr均显著高于正常未孕妇女；治疗后 URSA患者的 CD4+CD25brightT表达水平显著高于治疗前；妊娠成功患者外周血CD4+CD25+Tr及CD4+CD25brightT均较妊娠失败者显著升高，认为CD4+CD25+Tr参与了正常妊娠的维持，有可能是调控母胎界面局部免疫耐受形成的一个重要因素，对维持妊娠至关重要。这与本次研究结果基本一致，我们发现对URSA患者行主动免疫治疗，再次妊娠成功率达88.5%，效果明显，这与国内外报道的65%～95%的成功率一致。表明主动免疫治疗URSA是安全有效的，其可以提高CD4+CD25+Tr的表达水平，从而维持妊娠母胎之间的免疫耐受。同时本研究发现高剂量淋巴细胞主动免疫治疗效果要优于低剂量，可能低剂量不足以激发母体的免疫耐受，在临床上应采取高剂量的治疗方案。

目前对CD4+CD25+Tr免疫调节效应的确切机制尚存争议，主要有以下观点：一是通过细胞与细胞间的直接或间接接触改变T细胞的表型和功能，如抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化等广泛参与免疫耐受调节，维持机体内环境的稳定[10]；另一种是通过分泌多种细胞因子主要是IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，间接参与机体的免疫调节[11]。产生这一差异的原因可能与CD4+CD25+Tr作用于不同的细胞，或与其发挥不同的效应时所依赖的机制不同有关[12]。

综上所述，本文通过对主动免疫治疗URSA效果以及治疗前后CD4+CD25+Tr水平变化的观察提示，主动免疫治疗URSA是安全有效的，CD4+CD25+Tr在治疗前后有显著升高，其可能是调控母胎界面局部免疫耐受形成的一个重要因素，有可能成为免疫治疗效果的监测指标。CD4+CD25+Tr作用的具体机制目前仍有争议，将是未来研究的的重点。

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Efficacy of immunotherapy with different doses for unexplained recurrent spontaneous abortion

Objective To assess the efficacy of lymphocyte therapy with different doses for unexplained recurrent spontaneous abortion(URSA)．Methods One hundred and sixty five women with URSA received lymphocyte therapy with different doses．The outcomes of pregnancy were documented and the percentage of CD4+CD25+Tr in peripheral blood was measured by flow cytometry before and after lymphocyte therapy．Results Among 165 patients re-pregnancy was obtained in 121 cases,in whom 87 cases were successfully delivered,14 cases had early abortion and 20 cases were still under pregnancy with a success rate of 88．5%．Thirty seven cases with low dose treatment all obtained re-pregnancy,including 29 cases of successful delivery and 8 cases of early abortion with a success rate of 72．4%,which was significantly lower than that of high dose group(92．3%,P＜0．05)．After treatment the level of CD4+CD25brightT was significantly(P＜0．05)higher than before treatment．The CD4+CD25+Tr and CD4+CD25brightT levels in patients with successful pregnancy were significantly higher than those with failed pregnancy (P＜0．05）．Conclusion Lymphocyte therapy is effective for URSA women,particularly with high dose lymphocytes,which is associated with increased CD4+CD25brightT and CD4+CD25brightTr levels in peripheral blood．

URSA CD4+CD25+TrLymphocyte therapy