FasL基因-844T/C单核苷酸多态性与浙江地区食管鳞癌易感性关系的研究

2013-04-18王黎芳赵宏光李昕如伊媛琪

浙江医学 2013年20期

王黎芳赵宏光李昕如伊媛琪

王黎芳赵宏光李昕如伊媛琪

目的研究FasL基因启动子区-844T/C单核苷酸多态性（SNP）与食管鳞癌易感性的关系。方法提取248例食管鳞癌患者（患者组）和297例健康体检者（对照组）外周血基因组DNA，以PCR-RFLP检测FasL-844T/C SNP。分析、比较两组该位点SNP的表达差异。结果食管鳞癌患者与健康体检者的FasL基因启动子区-844位点基因型分布差异有统计学意义（P＜0．01）。以TT基因型为对照，TC基因型不增加食管鳞癌患病风险（P＞0．05），而CC基因型则显著减少食管鳞癌患病风险（调整后OR=0．425，95%CI=0．255～0．708，P＜0．01）。以T等位基因为对照，C等位基因显著减少食管鳞癌患病风险（调整后OR=0．597，95% CI=0．460～0．776，P＜0．01）。结论在浙江地区人群中FasL基因-844T/C SNP与食管鳞癌的易感性有关。

FasL基因单核苷酸多态性食管癌

细胞凋亡对人体器官发育、机体稳态及维持器官正常功能均发挥着重要的作用。研究显示，凋亡途径调节缺陷可导致肿瘤形成、浸润及转移[1]。细胞凋亡途径中关键基因的遗传学变异可影响肿瘤易感性。Fas-Fas配体（Fas ligand,FasL）系统是细胞和组织凋亡的主要途径，同时在免疫逃逸中发挥着重要作用，在癌发生、发展中起到重要作用。FasL是肿瘤坏死因子超家族的一员，与其受体Fas交联后能触发凋亡级联反应，引起Fas抗原表达细胞凋亡。FasL表达的增加会推动细胞的恶性转化及进展。影响凋亡信号传导的FasL基因功能性突变与多种类型癌发生的危险性相关[2]。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）对肿瘤的遗传易感性起到了重要作用。功能性SNP能改变基因表达及酶活性，影响肿瘤患病风险。Fas或FasL途径的SNP能够改变FasL的表达，在肿瘤遗传易感性中起到重要作用。本研究拟通过检测浙江地区食管鳞癌患者FasL基因启动子区-844T/C（rs763110）SNP，探讨该基因SNP与食管鳞癌易感性的关系，以期为食管鳞癌的发生、发展提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象选取2008-01—2011-10收治入浙江省肿瘤医院胸外科的食管鳞癌患者248例（患者组）。男215例，女33例，年龄46～76（61.4±6.5）岁。另选择同期健康体检者297例（对照组），男179例，女118例，年龄41～78（56.6±7.9）岁。在知情同意的情况下，每例抽取外周血3ml，肝素抗凝。

1.2 方法

1.2.1 提取基因组DNA 按照Blood Genome DNA Extraction Kit（购买自日本Takara公司）的操作说明提取基因组DNA。提取的样本DNA以TE缓冲液溶解，于-20℃保存。

1.2.2 PCR扩增 PCR扩增引物引物序列如下：正向引物（Fw Primer）：5′-CAGCTACTCGG AGGCCAAG-3′；反向引物（Rev Primer）：5′-GCTCTGAGGGGAGAGACCAT-3′。引物由上海英维杰基生物有限公司合成。PCR扩增试剂盒购自美国Invitrogen公司。反应体系（100μl）为：PCR Premix 50μl，Fw Primer 1μl，Rev Primer 1μl，DNA模板2μl，灭菌双蒸水46μl。反应条件：94℃预变性2min，随后94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸45s共35个循环，72℃最终延伸7min。反应结束后，取10μl PCR产物于3%琼脂糖（购买自日本Takara公司）凝胶电泳分析，Gelred（购买自美国Biotium公司）染色，凝胶成像系统观察目的条带，以确保有效扩增。随机抽取各组样本量10%的PCR产物送上海生工测序，测序结果应用 Pubmed BLAST程序（http://blast/ncbi/nlm/nih/gov/ Blast/cgi）搜索同源序列，确认目的片段扩增无误。

1.2.3 限制性片段长度多态性检测按照DNA Fagment Purification Kit（购买自日本Takara公司）操作，对PCR后的产物进行纯化。纯化后产物于3%琼脂糖电泳下进行分析，确保有效纯化。胶回收纯化后的PCR扩增产物以限制性核酸内切酶BsrDI（购买自美国NEB公司）酶切。酶切反应体系（20μl）为：10×NEB缓冲液2μl，DNA 6μl，100×BSA 0.2μl，内切酶0.5μl，灭菌双蒸水11.3μl；65℃水浴酶切4h。酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳分析，Gelred染色，凝胶成像系统观察目的条带。

1.3 统计学处理采用SPSS16.0统计软件。计数资料以频数与百分率表示。Hardy-Weinberg平衡检测样本人群该基因是否符合遗传平衡法则而具有恒定性。不同基因型患者的年龄、性别等差异比较均采用χ2检验。所有统计检验均为双侧概率检验。

2 结果

2.1 FasL-844T/C多态性检测以248例患者和297例健康人外周血基因组DNA为模板扩增FasL-814启动子区，目的片段长度为401bp（图1）。经BsrDI酶切，TT未突变纯合子（野生型）能完全被酶切，电泳条带为二条122bp、104bp；CC突变纯合子（突变型）不能被酶切，电泳条带为一条，分子量大小为401bp；TC杂合子电泳条带包含以上3种分子量条带（图2）。随机送样本测序进一步验证-844位突变（图3）。

图1 PCR扩增FasL启动子区（1～7：患者组样本，M：DNA Marker）

图2 BrsDI酶切检测FasL基因-844T/C多态性（2、4、6、8、10、12、14、16、19、22：未酶切产物；1、3、13、15、17、21、23：TT纯合子；5、9、11、18、20：TC杂合子；7：CC纯合子；M：DNA Marker）

2.2 基因频率分析及SNP与食管鳞癌关系分析患者组和对照组在年龄、性别构成中差异有统计学意义（P＜0.05）。患者组及对照组的TT、TC和CC 3种基因型构成比以及等位基因频率的比较见表1。鉴于随机样本在年龄与性别上差异有统计学意义，故在测算患病风险率（OR值）时以年龄和性别参数加以调整。

由表1可见，两组间三种基因型的分布差异有统计学意义。对照组基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=2.663，P=0.103＞0.05），表明所选样本具有群体代表性。患者组基因型TT∶TC∶CC=27.8%∶44.4%∶27.8%，对照组TT∶TC∶CC=17.5%∶43.1%∶39.4%，两组基因型比较差异有统计学意义（P＜0.01）。患者组T等位基因∶C等位基因=50.0%∶50.0%，对照组T等位基因∶C等位基因= 39.1%∶60.9%，两组基因频率比较差异有统计学意义（P＜0.01）。以TT基因型为对照，TC基因型不增加食管鳞癌患病风险，其OR值为0.957，95%CI为0.599～1.527，P=0.852。调整后的 OR值=1.081，95%CI为0.640～1.826，P=0.771。而CC基因型则显著性减少食管鳞癌患病风险，OR值为0.436，95%CI为0.271～0.702，P=0.001；调整后OR值=0.425，95%CI为0.255～0.708，P=0.001。以T等位基因为对照，C等位基因显著性减少食管鳞癌患病风险，OR值为0.587，95%CI为0.454～0.758，P=0.000；调整后OR值=0.555，95%CI为0.419～0.735，P＜0.01。

图3 FasL基因-844T/C PCR产物测序（A：122为G B：123为T）

表1 两组基因型构成及等位基因频率的比较[例（%）]

2.3 不同研究数据的差异分析将以上数据与Sun等[19]报道的FasL基因启动子区-844T/C SNP数据进行对照分析，见表2。

表2 本文数据与Sun等报道的数据的对照分析

由表2可见，患者组与对照组在基因型的比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；患者组的基因型比较差异有统计学意义（P＜0.01），对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

FasL基因定位于染色体1q23,包含4个外显子。它是一种40kD（281个氨基酸残基）的二型细胞表面糖蛋白，包括胞浆区，跨膜区以及胞外区。FasL的胞外区与FAS的胞外区结合，能触发凋亡级联反应，引起Fas抗原表达细胞的凋亡。FasL主要表达于NK细胞、激活的T细胞，以及眼、脑、生殖器官等免疫豁免细胞。FasL具有高度的多态性。研究最广泛的多态性是位于FasL启动子区-844T/C（rs763110）。此功能多态性位于假定的CAAT增强子结合蛋白β转录因子结合模体。FasL-844T＞C能影响FasL的启动子活性，这种变异能强烈影响FasL的表达。FasL-844 C等位基因比FasL-844 T等位基因人群的FasL基础表达增高[3]。提示FasL-844 T/ C多态性会影响FasL的表达及FasL介导的信号，最后影响肿瘤易感性。

人们已经发现在多种肿瘤中有FasL表达增多现象[4-6]，FasL表达的增高与肿瘤形成、肿瘤侵袭行为以及免疫逃逸有关。肿瘤组织中FasL表达增高与各种肿瘤预后不良有关。动物实验显示，以FasL的抗体阻断FasL的作用将导致肿瘤负荷以及克隆形成效价显著性减少[7]。

FasL高表达可通过两种机制造成免疫逃逸：（1）通过杀伤Fas敏感的淋巴细胞来增加肿瘤细胞反攻免疫系统的能力，从而与癌的发展有关[4-8]。（2）T淋巴细胞的激活诱导的细胞死亡（Activation-induced cell death，AICD）可以造成淋巴细胞的自身凋亡，帮助肿瘤细胞逃逸T淋巴细胞的杀伤作用。FasL-844C等位基因导致T淋巴细胞FasL高表达，这可以使T淋巴细胞的AICD作用增强，导致有效的免疫监视作用减弱，从而增加肿瘤的易感性[9]。

研究显示，FasL-844T/C SNP与肺癌、宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤患病风险增加有关[10-14]。有一项荟萃分析提示，FasL-844C等位基因与增加肿瘤的患病风险相关[15]。另一项病例对照研究提示，FasL-844T等位基因可能对肿瘤的患病风险起到了保护作用[16]。但也有研究显示不同的结论。Ter-Minassian等[17]研究发现，60岁以下FasL-844 T/C或T/T基因型人群与C/C基因型人群相比较，非小细胞肺癌患病风险显著增高。Lei等[18]研究发现FasL-844 CT/TT基因型与FasL-844CC基因型相比较，能显著增加头颈部鳞癌后第二原发性癌的患病风险。Sun等[19]研究了588例食管鳞癌患者的的FasL-844T/C SNP与食管鳞癌易感性的关系，并以648例健康人作为正常对照。研究显示，FasL-844 CC基因型人群与FasL-844TT基因型人群相比较，食管鳞癌患病风险显著增高。

本研究显示患者组和对照组无论是在基因型还是等位基因频率上差异均有统计学意义。按照基因型进行比较，以TT基因型为对照，CC基因型的粗OR为0.436，考虑到年龄和性别在两组间有差异，根据年龄、性别调整后的OR为0.425，差异依然有统计学意义。提示CC基因型是食管鳞癌易感性的保护性因素。按照等位基因频率进行比较，C等位基因也是食管鳞癌易感性的保护性因素。

本研究与Sun等报道的FasL-844 T/C SNP与食管鳞癌易感性相关性研究的结果有差异。因此，我们将本研究数据与Sun等报道的FasL基因启动子区-844T/ C SNP数据进行统计学分析。除对照组等位基因分布在两个研究中无差异以外，其余分布均存在差异。我们认为，第一，两个研究中研究的地区不一样，人的基因型可能有所差异。有研究显示，不同地区，不同种族FasL-844 T/C SNP有所差异。第二，我国南北方食管鳞癌的发病因素可能有所差异。第三，FasL-844 CC基因型人群的淋巴细胞的FasL表达较高，同时，有研究显示正常食管黏膜细胞也有FasL表达，这些可能是对食管鳞癌的保护性屏障。正常机体较高的FasL表达水平可能对食管的细胞转化有防御作用。

本研究结果显示FasL-844 CC基因型是食管鳞癌易感性的保护性因素，C等位基因也是食管鳞癌易感性的保护性因素，在浙江地区人群中FasL基因-844T/C SNP可能与食管鳞癌的易感性有关。

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FasL gene-844T/C mutation in relation to susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province

Objective To explore the relationship between FasL gene-844T/C single nucleotide polymorphism（SNP）in promoter and susceptibility of esophageal cancer in Zhejiang Province． Methods The clinical data of 248 patients with esophageal squamous cell carcinoma admitted in Zhejiang Cancer Hospital from January 2008 to October 2011 were collected and 297 healthy individuals were selected as normal controls．Genomic DNA was extracted from peripheral whole blood．PCR-RFLP technique was carried out to detect FasL-844T/C SNP．χ2test and logistic regression was carried out for analysis．Results There was significant difference in genotypes of FasL gene promoter-844 locus between patients and controls(P＜0．05)．CC genotype significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk(adjusted OR=0．425,95% CI 0．255～0．708,P＜0．01)．Compared to T allele,C allele significantly reduced the prevalence of esophageal squamous cell carcinoma risk（adjusted OR=0．597,95%CI 0．460～0．776,P＜0．01）．Conclusion FasL gene-844T/C SNP is associated with the occurrence of esophageal squamous cell carcinoma in population of Zhejiang Province．

FasL gene SNP Esophageal cancer