受体型酪氨酸激酶变异体对结肠癌细胞侵袭能力影响的研究

杜卫东 何超 王达 马建军

受体型酪氨酸激酶变异体对结肠癌细胞侵袭能力影响的研究

杜卫东 何超 王达 马建军

目的 研究受体型酪氨酸激酶变异体RON△160表达对结肠癌细胞迁移、浸润能力的影响。 方法 将携有受体型酪氨酸激酶RON变异体RON△160 cDNA的质粒转染入结肠癌细胞株RKO细胞，挑选稳定转染克隆，以过河实验和Transwell趋化运动实验检测细胞迁移能力；Matrigel基质浸润实验检测细胞浸润能力，Western blot检测E-钙粘连蛋白（E-cadherin）表达的变化。 结果 转染RON△160后RKO细胞的过河时间为（38．00±1．63）h，明显短于未转染组与载体对照组的（69．50±2．52）h与（72．00±1．63）h，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。转染后RKO细胞的穿膜能力显著增强，穿膜细胞数为（59．22±6．67）个/HP、未转染组为（25．90±4．56）个/HP、载体对照组为（28．33±6．75）个/HP，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。转染RON△160后，RKO细胞中E-cadherin表达降低（P＜0．05）。 结论 RON△160转染可以降低E-cadherin表达，降低肿瘤细胞间的黏附性，增加结肠癌细胞RKO的移动、浸润能力。RON△160的表达可能是结肠癌浸润、转移的机制之一。

受体型酪氨酸激酶变异体 E-钙粘连蛋白 结肠肿瘤 肿瘤浸润转移

研究发现，受体型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）在调节细胞生长、分化和生存中起着重要作用，并与肿瘤的发生、发展相关。RON（recepteur d'origine nantais）是RTKs中的一种，体外研究发现RON的激活可引起上皮细胞的分化、迁移和基质侵袭。Zhou等[1]报道了RON的3种异构体，分别是RON△165、RON△160和RON△155，本研究着重研究RON△160在结肠癌迁移浸润中的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂 Lipofectamine转染试剂盒为Invitrogen公司产品；Hygromycin B购于Roche公司；兔抗RON β链C末端多肽IgG由王明海教授惠赠；鼠抗人E-钙粘连蛋白（E-cadherin）一抗、巨噬细胞刺激蛋白（macrophage stimulating protein,MSP）和细胞浸润小室均为BD公司产品；HRP羊抗兔IgG及HRP羊抗鼠IgG购于Jackson公司；48孔标准趋化小室和聚碳酸脂微孔滤膜购于Neuro Probe公司。

1.2 细胞培养和转染

1.2.1 细胞株与质粒 结肠癌细胞株HT-29、RKO、DLD1、SW620、SW480为本实验室所购存。真核表达载体pcDNA3.1-RON△160为王明海教授惠赠。

1.2.2 细胞转染与克隆化培养 （1）取对数生长期的RKO细胞 (70%～80%融合)5×104个/孔接种于24孔板中培养24h后，以不同终浓度加入Hygromycin B，观察14d，得出其最小生长抑制浓度200mg/L。（2）取对数生长期的RKO细胞接种于直径6cm板中培养至80%融合。重组质粒pcDNA3.1-RON△160 2μg与 lipofectamineTM15μl混匀后转染细胞，12～18h后更换为普通培养基继续培养24 h，以100∶1稀释传代至9cm直径的培养皿以200 mg/L Hygromycin B选择培养7～10d，待单个克隆肉眼可见时，以0.25%的胰酶消化挑选克隆。同时以转染空载体的细胞RKO-pcDNA3.1为载体对照。

1.3 体外跨室趋化运动能力的检测 趋化小室下室每室加入29μl含MSP的RPMI 1640无血清培养基，MSP的浓度梯度分别为0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0×103nmol/ L。覆盖Ⅳ型胶原包被的聚碳酸酯微孔滤膜和乳胶隔垫，安装好上室。调整细胞浓度为4×105个/ml，上室加入细胞悬液45μl/室，每组2个复孔。37℃、5%CO2孵育5h，取出聚碳酸酯微孔滤膜，滤膜上面细胞用特殊刮膜器刮除干净，下层黏附的穿膜细胞以瑞氏染液固定染色15min。于镜下随机取上、下、左、右、中心5个高倍视野，计数穿膜细胞数，取每个视野的平均数代表细胞的侵袭能力；实验重复3次。

1.4 过河实验（划痕实验） 生长旺盛的RKO细胞以0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清培养基制备成1.5×105个/ml的细胞悬液，以1ml/孔接种于24孔板，培养至基本铺满。PBS洗涤1遍，100μl移液器头在孔中划一直线，PBS再洗涤2次，加入含MSP的培养液(1ml/孔)至终浓度2×103nmol/L继续培养，对照加入等量无药培养液。24h后每2h观察1次，至划痕被细胞填满。观察划痕填满时间，实验重复3次。

1.5 体外Matrigel基质浸润实验 Transwell小室杯底由8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜封闭，滤膜上均匀涂布人工基质Matrigel，主要含有Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白。上室以无血清培养基室温水化2h后，缓慢加入细胞2×105/室（0.3ml），下室加入含10%小牛血清的培养基0.5ml和2.0×103nmol/ml MSP，每组2个复孔，培养24h后，弃上室液，拭去上层膜面细胞，穿过基底膜的细胞黏附于膜下层，以瑞氏染液染色10min，洗涤后100倍光镜下计数穿膜细胞，每膜计算5个视野，取均值；实验重复3次。

1.6 Western blot检测细胞中RON和E-cadherin的表达 收集细胞后提取蛋白，上样检测，化学发光试剂显色，胶片贴近曝光，显影、定影后以Hp Scanjet 4 700c扫描仪扫描，Kodak Digital Science 1D软件分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS14.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析和重复测量设计的方差分析。

2 结果

2.1 RON△160转染后细胞形态学变化 RON△160转染并稳定表达后，RKO细胞形态由原来呈短棒状、纺锤形、多边形变为梭形或形态异常的狭长形，见图1。

图1 RON△160转染后RKO细胞的形态学变化（A：未转染RKO细胞；B：转染RON△160的RKO细胞；C：载体对照的RKO细胞，×100）

2.2 Western blot检测细胞中RON的表达 Western blot检测发现RKO细胞不表达RON，转染RON△160后，经Western blot鉴定筛选出RON△160阳性表达克隆，而未转染细胞与载体对照细胞均无表达，见图2。

图2 Western blot检测细胞中RON△160的表达（A：未转染RKO细胞；B：载体对照的RKO细胞；C：转染RON△160的RKO细胞；D：阳性对照NIH3T3-RON细胞）

2.3 转染细胞中E-cadherin的表达 Western blot提示转染成功后，RON△160-RKO细胞中E-cadherin表达明显低于载体对照细胞和未转染RKO细胞（P＜0.05），见图3。

2.4 体外跨室趋化运动能力实验 转染RON△160后RKO细胞的穿膜移动能力显著增强（P＜0.01），且随着配体MSP浓度的增加而增强，当浓度达2nmol/L以上时，增势趋缓。而未转染组与载体对照组即使有MSP的刺激，其移动能力也无明显增强，见图4。

图3 转染后各组细胞内E-cadherin表达

图4 转染后各组细胞趋化运动能力比较

2.5 过河实验 转染RON△160后并经MSP刺激后，RKO细胞迁移能力明显增强（P＜0.01）；无MSP刺激情况下，其过河时间也比载体对照组和未转染细胞短（P＜0.05），见表1。

表1 转染后各组细胞迁移能力比较（h）

2.6 体外Matrigel基质浸润实验 RON△160转染细胞穿膜数为（59.22±6.67）个/HP、未转染RKO细胞为（25.9±4.56）个/HP、载体对照组为（28.33±6.75）个/HP，有统计学差异（P＜0.05），见图5。

图5 转染后各组细胞体外基质浸润能力比较

3 讨论

RON又称为MSP受体（MST1R），其cDNA最早从角质细胞中被克隆[2]。编码基因位于染色体3p21，是一个肿瘤中常见的突变区域[3-4]。RON基因包含20个外显子，其主要产物是一种糖基化单链前体，水解断裂后形成由40kd的α链和150kd的β链组成的、由二硫键连接的杂二聚体，β链包括三个部分，一段暴露于细胞膜外，一小段跨膜，另一段具有酪氨酸激酶活性的部分在胞浆内[2]。其配体是MSP，MSP由肝脏产生，又称为类肝细胞生长因子，其分子量为78kd，为二硫键相连的双链结构，MSP与RON结合后第1 238和1 239位的酪氨酸磷酸化，可增加激酶活性。

RON属于RTK亚家族中成员之一,主要表达在上皮来源的细胞，活化后引起细胞转化、生长、迁移和基质侵袭。Zhou等[1]研究发现RON有3种变异体RON△165、RON△160和RON△155。Lu等[5]又报道了RON△110和RON△55、RONE5/6in等变异体并重点研究了RON△160。RON△160是由RON缺失了外显子5、6编码的β链上第一个免疫球蛋白丛状蛋白域的109个氨基酸拼接而成。本研究提示转染RON△160后，RKO细胞过河时间较未转染组与载体对照组明显缩短。体外趋化运动能力实验也证实转染RON△160后RKO细胞的穿膜移动能力显著增强，且随着配体MSP浓度的增加而增加。Lu等[5]稳定转染RON160的MDCK细胞，在无MSP刺激时16h的过河率达86%，有MSP刺激时16h的过河率达93%。与其他研究一致，本研究结果表明RON△160的表达可使RKO细胞纵向的穿膜能力与横向的移动能力均增加。同时，表达RON△160的RKO细胞基质浸润能力也增加。在Lu等[5]的研究中，转染并表达RON△160的NIH3T3细胞在软琼脂中克隆的形成数量及大小均显著高于对照，显示了RON△160与成瘤作用的关系。

E-cadherin是一种跨膜糖蛋白，广泛分布于上皮组织中，介导同种细胞间的黏附并维持上皮细胞的正常形态。E-钙基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因[6]。在杜卫东等[7]既往的研究中发现RKO细胞转染并高表达野生型RON后，细胞形态变为长梭形，E-cadherin表达降低，而本研究中表达RON△160的RKO细胞同样出现了类似变化，这种变化称为上皮细胞间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMTs）。其标志是上皮特性的丢失和间质表型的获得，细胞表型梭型化，细胞连接处E-cadherin减少，细胞骨架重构，并表达间质细胞特有的细胞标志如α-SMA、Vimentin等。EMTs多发生在伤口愈合、肿瘤进展过程中，大多数浸润性或转移性肿瘤存在部分或全部EMTs，表明EMTs是体内一些上皮细胞性癌浸润转移的的重要步骤[8]，是导致肿瘤细胞间黏附松散，易从原发部位脱落，启动肿瘤浸润转移的第一步。一般说肿瘤的浸润转移遵循规律：瘤细胞亚克隆出现→黏附力减弱使得瘤细胞解离→突破基底膜并溶解细胞外基质→移动或漂流到他处与基底膜黏附、定植→肿瘤血管形成及增殖转移灶形成。肿瘤细胞形态变为梭形，可使细胞的移动能力和基质浸润能力增强，更容易破坏邻近正常组织，进入血管淋巴管，从而发生远处转移。这种促进迁移、浸润的变异体剪切现象在结肠癌、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤中多有发现[9-10]，但在正常组织中未发现。这提示RON表达异常增高及RON变异体的蓄积可能在结直肠癌的发展、转移中起重要作用。

Zhang等[11]的研究还提示RON△160还可通过降低紧密连接蛋白claudin-1、重分布claudin-3、claudin-4从而破坏细胞间的紧密连接，这样导致细胞发生EMTs同时又改变细胞间通讯，增强成瘤性和迁移能力。

综上所述，RON△160转染可以降低肿瘤细胞间的黏附性，增加细胞的移动、浸润能力，提示RON变异体RON△160表达可能是结肠癌浸润、转移的机制之一，具体有待于进一步研究证实。

[1]Zhou Y Q,He C,Chen Y Q,et al．Altered expression of the RON receptor tyrosine kinase in primary human colorectal adenocarcinomas:generation of different splicing variants and their oncogenic potential[J]．Oncogene,2003,22(2):186-197．

[2]Ronsin C,Muscatelli F,Mattei M G,et al．A novel putative receptor protein tyrosine kinase of the met family[J]．Oncogene,1993,8 (5):1195-1202．

[3]Angeloni D,Danilkovitch-Miagkova A,Ivanov S V,et al．Gene structure of the human receptor tyrosine kinase RON and mutation analysis in lung cancer samples[J]．Genes Chromosomes Cancer,2000,29(2):147-156．

[4]Zabarovsky E R,Lerman M I,Minna J D．Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers[J]．Oncogene,2002,21(45):6915-6935．

[5]Lu Y,Yao H P,Wang M H．Multiple variants of the RON receptor tyrosine kinase:biochemical properties tumorigenic activities and potential drug targets[J]．Cancer Lett,2007,257(2):157-164．

[6]Fiocca R,Luinetti O,Villani L,et al．Molecular mechanisms involved in the pathogenesis of gastric carcinoma;interactions between genetic alteraction,cellular phenotype and cancer histotype[J]．Hepotogastroenterology,2001,48(42):1523-1530．

[7]杜卫东,何超,王达,等．巨噬细胞刺激蛋白受体过表达对癌细胞侵袭能力的初步研究[J]．中华消化杂志,2006,26（5）：304-307．

[8]Jean P T．Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression[J]．Nat Rev Cancer,2002,2(6):442-454．

[9]Eckerich C,Schulte A,Martens T,et al．RON receptor tyrosine kinase in human gliomas:expression,function,and identification of a novel soluble splice variant[J]．J Neurochem,2009,109(4): 969-980．

[10]Park Y L,Lee G H,Kim K Y,et al．Expression of RON in colorectal cancer and its relationships with tumor cell behavior and prognosis[J]．Tumori,2012,98(5):652-662．

[11]Zhang K,Yao H P,Wang M H．Activation of RON differentially regulates claudin expression and localization:role of claudin-1 inRON-mediated epithelialcellmotility[J]．Carcinogenesis,2008, 29(3):552-559．

Receptor tyrosine kinase RON△160 on motile/invasive ability of human colorectal cell line RKO

Objective To investigate effects of receptor tyrosine kinase RON△160 on motile/invasive ability of human colorectal cancer cell line RKO．Methods The eukaryotic expression vector pcDNA3．1-RON△160 was transfected into colorectal cancer RKO cells and a stable expression clone was obtained．The motile ability of RKO cells was assessed by wound healing test and the Transwell migration assay;the invasive ability was tested by Matrigel invasion method and the expression of E-cadherin was detected by Western blot． Results Transwell chemotaxis assay revealed that the motile ability of transfected RKO cells was greatly enhanced(P＜0．01)．The wound healing time of transfected RKO cells(38．00±1．63h)was significantly shorter than those in parental cells(72．00±1．63h)and control cells(69．50±2．52h)(P＜0．05)．The penetrated cells for above three groups were 59．22±6．67/HP,25．90±4．56/HP and 28．33±6．75/HP,respectively in the Matrigel invasion test(P＜0．01)．E-cadherin expression decreased statistically in pcDNA3．1-RON△160 transfected cells(P＜0．05)．Conclusion Transfection of RON△160 to colorectal cancer RKO cells can decrease of E-cadherin expression and cell-cell adhension,while migration/invasion ability is enhanced,indicating RON△160 might play roles in migration/invasion of colorectal cancer．

Receptor tyrosine kinase variantE-cadherin Colorectal carcinoma Migration/invasion

2012-12-03）

（本文编辑：胥昀）

国家自然科学基金资助项目（30471986）

310006 杭州，浙江省中医院普外科八病区（杜卫东）；浙江大学医学院附属邵逸夫医院临床研究所（何超、王达、马建军）

何超，E-mail：hzdwd2004@sina.com