当归提取液对HaCaT细胞凋亡的影响及其机制

郑益志 朱金土 贾丽莹 曹毅 余土根

当归提取液对HaCaT细胞凋亡的影响及其机制

郑益志 朱金土 贾丽莹 曹毅 余土根

目的 研究当归提取液在体外诱导人角质形成细胞株HaCaT细胞凋亡的作用及其可能的机制。 方法 采用MTT法检测不同浓度当归提取液对HaCaT细胞增殖的影响，流式细胞仪FITC-Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况，分光光度法检测细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）活性的改变情况。 结果 浓度≥10mg/ml的当归提取液处理后HaCaT细胞增殖受到抑制，早期凋亡率显著增高（均P＜0．01），细胞内Caspase-9活性明显增加（P＜0．05），均呈浓度依赖性。 结论 在一定浓度范围内，当归提取液可抑制诱导HaCaT细胞凋亡，Caspase-9活性增加可能是其诱导凋亡的机制之一。

当归提取液 HaCaT细胞 细胞凋亡 Caspase-9

银屑病是一种以角质形成细胞过度增殖以及分化异常为特征的炎症性皮肤病[1]。当归属伞形科植物，性味甘、辛、温，归肝、心、脾经，具有补血、活血、调经、止痛、润肠的功效。当归中包含挥发油、多糖、阿魏酸等多种化学成分[2]，临床上作为常用中药用于银屑病静止期和消退期治疗，用以养血润肤，治疗银屑病取得明显疗效[3]，但关于当归抗角质形成细胞增殖机制的相关研究开展不多。本研究以人角质形成细胞株HaCaT细胞为对象，观察当归提取液对HaCaT细胞的影响，结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 HaCaT细胞株（由浙江省中医院中心实验室保存），当归提取液（由浙江省中医药研究院提取），四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma），Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自南京凯基生物有限公司，Caspase-9活性检测试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 药物配置 取当归生药10g，加入100ml蒸馏水浓煎至20ml，去渣取上清液，加入等体积的无水乙醇过夜，低温超速4 000r/min离心10min，取上清液，水浴加热以除去乙醇并浓缩至10ml，即浓度为1g/ml。滤膜除菌后分装至1.5ml离心管，-80℃冰箱保存。使用时用培养液稀释，浓度按预实验结果选取。

1.2.2 细胞培养和处理 HaCaT细胞以含10%胎牛血清的1640培养液常规培养，每日换液，细胞单层铺满瓶底时传代；将第3、4代HaCaT细胞以密度1×107/ml接种于1640培养液中，继续培养。

1.2.3 当归提取液对HaCaT细胞增殖的影响 取对数生长期的HaCaT细胞，调整细胞浓度至1×105个/ml接种于96孔板，每孔200μl，37℃，5%CO2培养箱中培养细胞80%融合后分别加入5、10、20、30mg/ml的当归提取液，正常对照组只加1 640培养液，每种浓度设6个复孔，孵育24h后，每孔加入20μlMTT（5mg/ml），继续培养4h后终止培养，每孔加入二甲亚砜150μl，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度值。以上实验重复3次，计算增殖抑制率及IC50。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 选取对数生长期的HaCaT细胞，调整至8×105/ml的密度，接种于6孔板，细胞80%融合后加入5、10、20、30mg/ml的当归提取液，继续孵育24h，调整细胞密度为1×106/ml，分别加入Annexin V-FITC 5μl和PI 10μl，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Caspase-9活性测定 96孔培养板内处于对数生长期的HaCat细胞加入不同浓度当归提取液，继续培养24h，胰酶消化细胞，每2×106个细胞加入100μl裂解液后，重悬细胞,冰浴裂解15min，离心，上清液移至预冷的离心管中，按说明书的反应体系加入相应的试剂后混匀，37.4℃孵育60～120min，颜色变化明显时即测定样品中Caspase-9催化底物产生的吸光度值。

图1 HaCaT细胞形态学观察（A：正常对照组；B：10mg/ml当归组；C：20mg/ml当归组；D：30mg/ml当归组）

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，进行正态分布检验和方差齐性检验后，行单因素方差分析。计数资料比较采用χ2检验

2 结果

2.1 HaCaT细胞形态学观察 倒置显微镜下观察，正常HaCaT细胞贴壁生长，呈多角形，境界清楚，排列紧密。5mg/ml当归处理组细胞生长稍缓慢，与对照组相比形态无明显差异，当归浓度≥10mg/ml时，细胞贴壁性显著降低，间隙变大，部分细胞体积变小，与周围的细胞脱离，细胞形态变圆或不规则，可见大量漂浮细胞。

HaCaT细胞形态学变化见图1。

2.2 当归对HaCaT细胞的增殖抑制作用 MTT结果

显示，5mg/ml当归组与正常对照组比较,无统计学差异（P＞0.05）；当归提取液浓度为10mg/ml时吸光度值出现下降,与正常对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）；且随着当归提取液浓度的增高下降显著，各组与5mg/ml当归提取液组比较，均有统计学差异（均P＜0.01），见表1。

表1 不同浓度当归对HaCat细胞增殖及凋亡率的影响

2.3 流式细胞仪检测HaCaT细胞凋亡 正常对照组、5、10、20、30mg/ml当归组细胞的凋亡率流式细胞仪检测结果分别为4.72%、5.08%、7.52%、14.96%、30.01%，5mg/ml当归组细胞凋亡率与正常对照组比较，无统计学差异（P＞0.05），当归浓度≥10mg/ml的各组HaCaT细胞凋亡率明显升高，与正常对照组比较差异均有统

计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.4 Caspase-9活性检测 5mg/ml当归处理后，HaCaT细胞内Caspase-9与正常对照组相比未见明显升高（P＞0.05）。而当归浓度≥10mg/ml的各组，吸光度值明显升高，与正常对照组相比差异均有统计学意义（均P＜0.01），且与5mg/ml当归提取液组间差异也有统计学意义（P＜0.05或0.01），见表2。

表2 不同浓度当归对HaCat细胞内Caspase-9活性的影响

3 讨论

银屑病发病与细胞凋亡的关系逐渐受到越来越多学者的重视，已有研究发现银屑病角质形成细胞凋亡增加与异常的角质形成细胞增殖活化密切相关，角质形成细胞的过度增殖与凋亡增加伴随着银屑病的发病[4-6]。因此，抑制细胞增殖以及诱导细胞凋亡对该病治疗具有重要临床意义。银屑病的治疗颇为棘手，到目前为止尚未开发出理想的治疗药物，近年来,从中草药中寻找新的治疗药物逐渐成为研究的热点[7]。

于春水等[8]发现当归多糖可通过阻止HaCaT细胞进入S期而抑制其DNA合成，从而对HaCaT细胞的增殖具有显著抑制作用,而当归提取液对HaCaT细胞的作用机制研究较少。本研究结果提示，当归提取液在低浓度(＜5mg/ml）对HaCaT细胞增殖无抑制作用，达到一定浓度时（≥10mg/ml）对HaCaT细胞体外增殖有明显的抑制作用，且随着浓度增加，抑制细胞增殖的能力也增加，抑制作用呈浓度依赖性。

细胞凋亡与许多生物学过程和疾病的发生、发展有密切的关系。目前研究发现细胞凋亡主要经过两条通路[9]，由死亡受体途径介导的外源性通路和线粒体途径介导的内源性通路，Caspase-9参与细胞凋亡的起始，是内源性通路的关键酶。一些药物可以通过诱导细胞凋亡，减轻表皮增殖，改善皮损分化，而被广泛应用于银屑病治疗[10-11]。研究发现从当归中提取的水溶性有效成分阿魏酸钠能诱导人EBL-7404肝癌细胞的凋亡[12]，但其具体作用机制尚待进一步研究。本研究通过不同浓度的当归提取液处理细胞发现，当归提取液浓度≥10mg/ml时，能够诱导HaCaT细胞株的早期凋亡，倒置相差显微镜下可观察到明显的细胞形态学改变，Annexin V-FITC双染法也进一步证实了当归诱导HaCaT细胞发生凋亡。本研究还发现，浓度≥10mg/ml当归提取液处理后，HaCaT细胞内Caspase-9随着浓度增加逐渐升高，且不同浓度的当归提取液组与正常对照组之间比较，均有统计学差异，表明当归诱导细胞凋亡可能与激活内源性凋亡途径有关，并呈浓度依赖性。

总之，当归对HaCaT细胞增殖抑制作用的机制尚不完全清楚。本研究显示,当归提取液达到一定浓度（≥10mg/ml）对HaCaT细胞体外增殖有明显的抑制作用，两者呈量效关系。此外，当归提取液可通过Caspase-9介导的线粒体途径内源性通路促进HaCaT细胞凋亡，其可能是当归治疗银屑病等角质细胞增殖性皮肤病的作用机制。通过研究当归等中药的抗角质形成细胞增殖并诱导凋亡的机制，为临床应用提供了实验依据，将有利于开发更有效治疗银屑病的中药制剂。

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Effects of angelica extracts on apoptosis of human keratinocytes and its mechanism

Angelica extracts HaCaT cells Apoptosis Caspase-9

2012-10-17）

（本文编辑：胥昀）

浙江省自然科学基金资助项目（Y2100759）

310006 杭州，浙江省中医院皮肤科（郑益志系浙江中医药大学博士研究生）

曹毅，E-mail：zrcstar@sina.cn

【 Abstract】Objective To investigate the effects of angelica extracts on the apoptosis of HaCaT cells and its mechanism．Methods MTT assay was used to observe the effects of different concentrations of angelica extracts on the proliferation of HaCaT cells．Apoptosis was evaluated by flow cytometry．The activity of caspase-9 was detected by fluorescent analysis．Results After treatment with angelica extracts(≥10mg/mL),the percentage of early apoptotic cells and the levels of caspase-9 activity in Ha-CaT cells were significantly increased．Conclusion Angelica extracts inhibits cell proliferation and induces apoptosis of HaCaT cells,which may be associated with the activation of caspase-9．