拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异的相关因素分析

朱少明 龚婷婷 吴锋 朱彪

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎YMDD变异的相关因素分析

朱少明 龚婷婷 吴锋 朱彪

目的 分析拉米夫定治疗后慢性乙型肝炎酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）变异的相关因素。方法 对169例经拉米夫定治疗12个月后的慢性乙型肝炎患者发生YMDD变异情况进行回顾性分析。采用荧光定量PCR和PCR产物测序等方法检测慢性乙型肝炎拉米夫定治疗前、治疗后HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态、ALT水平等指标。 结果 在169例患者中，基因型B共76例（44．97%）,基因型C共93例（55．03%）。拉米夫定治疗12个月后，46例（27．22%）患者发生YMDD变异，其中，基因型B变异27例（35．53%），基因型C变异19例（20．43%），两者有统计学差异（P＜0．05）。YMDD变异组患者治疗前HBV DNA水平显著高于YMDD未变异组[（7．26±0．58 vs6．44±0．65）log拷贝/ml，P＜0．05]。HBeAg阳性患者YMDD变异率显著高于HBeAg阴性患者（38．10%vs20．75%，P＜0．05）。YMDD变异组与未变异组在治疗前ALT水平上无明显差异[（136．09±28．21 vs 124．15±26．52）U/L，P＞0．05]。 结论 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎发生YMDD变异与HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态等密切相关。拉米夫定治疗前，检测HBV基因型、HBV DNA水平，HBeAg状态等指标对慢性乙型肝炎抗病毒治疗具有重要意义。

慢性乙型肝炎 拉米夫定 YMDD变异 相关因素 基因型

乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染是导致肝硬化和肝细胞癌的最主要因素，拉米夫定是目前治疗慢性乙型肝炎的主要药物之一。然而，由于HBV发生酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）变异（即YMDD变异）可出现拉米夫定耐药，主要表现为患者HBV DNA阳转，ALT升高[1]，甚至出现病情加重和恶化[2]。本研究对169例慢性乙型肝炎患者经拉米夫定治疗12个月后发生YMDD变异情况进行回顾性分析，探讨拉米夫定治疗前HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态、ALT水平与YMDD变异的相关性，为临床抗病毒治疗提供帮助。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2007-08—2010-11在浙江大学医学院附属第一医院门诊或住院的慢性乙型肝炎患者共169 例，诊断均符合病毒性肝炎防治方案[3]。其中男95例，平均年龄48岁；女74例，平均年龄43岁。全部患者仅接受拉米夫定治疗，治疗周期1～3年。在拉米夫定治疗前检测ALT、HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态、YMDD变异等指标；治疗后每隔3个月定期复查以上指标。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学指标 乙型肝炎病毒指标采用酶联免疫吸附法测定，肝功能指标采用日立生化全自动分析仪测定。HBV DNA水平采用荧光定量PCR法在标准PCR实验室测定。

1.2.2 HBV基因型分析 HBV基因型采用酶联免疫吸附法测定[4]。按照HBV基因型试剂盒（日本东京免疫研究所）说明书进行操作，该试剂盒采用乙型肝炎病毒前S2抗原（PreS2抗原）的单克隆抗体（m、k、s和u）作为一抗研制而成。实验结果判断依据：m阳性提示基因型B，k和s阳性提示基因型C。

1.2.3 HBV YMDD变异分析 采用PCR产物测序的方法检测HBV YMDD变异。主要实验步骤包括：（1）HBV DNA聚合酶基因PCR扩增：扩增片段长度589 bp，反应参数：94℃ 2min，94℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 45s，35个循环；72℃10min；4℃终止。（2）PCR产物测序：按试剂盒说明书进行操作，在MagaBACE 500测序仪上测定PCR产物序列。所获得核酸序列与标准HBV比对，进行HBV的YMDD变异分析，具体参见文献[5]。

1.3 统计学处理 采用SPSS15.0统计软件，计量资料以表示，组间差异比较采用t检验；组间率比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 HBV基因型与YMDD变异的关系 169例患者中，76例（44.97%）为HBV基因型B，93例（55.03%）为HBV基因型C，未发现其他基因型。拉米夫定治疗前，B、C基因型患者在性别、年龄、ALT等方面无统计学差异（P＞0.05），见表1。经过拉米夫定治疗12个月后，共46例（27.22%）发生YMDD变异。B基因型中，发生YMDD变异有27例（35.53%），C基因型中有19例（20.43%），两组变异率比较具有统计学差异（P＜0.05）。YMDD变异组与未变异组患者治疗前在年龄、性别等方面无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表1 拉米夫定治疗前不同基因型患者临床资料比较

2.2HBV DNA水平与YMDD变异的关系 46例YMDD变异慢性乙型肝炎患者治疗前HBV DNA水平均值为（7.26±0.58）log拷贝/ml，123例未变异患者治疗前HBV DNA水平均值为（6.44±0.65）log拷贝/ml，两者比较具有统计学差异（P＜0.05），见表2。

2.3 HBeAg状态与YMDD变异的关系 169例患者中，63例HBeAg阳性，106例HBeAg阴性。在HBeAg阳性患者中，发生YMDD变异24例（38.10%）；而HBeAg阴性患者中，发生YMDD变异22例（20.75%），两者比较具有统计学差异（P＜0.05），见表2。

2.4 ALT与YMDD变异的关系 46例YMDD变异患者治疗前ALT均值为（136.09±28.21）U/L，123例未变异患者治疗前ALT均值为（124.15±26.52）U/L，两者比较无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 YMDD变异组与未变异组患者拉米夫定治疗前临床特征比较

3 讨论

长期服用拉米夫定，可以导致慢性乙型肝炎出现耐药现象，已经证实拉米夫定耐药与HBV聚合酶YMDD变异密切相关，即YMDD基序中的蛋氨酸（M）被异亮氨酸（I）或缬氨酸（V）所取代。现有研究报道：1、2、3年拉米夫定治疗后，YMDD变异率分别为14%、38%、49%[1，6]。本研究结果显示：经过12个月拉米夫定治疗后YMDD变异率为27.22%，高于其他学者的研究报道[6]。然而，日本学者报道[7]：经过1年的拉米夫定治疗，日本慢性乙型肝炎的YMDD变异率高达57.4%。因此，进行拉米夫定治疗所导致的YMDD变异因素的分析，对核苷类药物抗病毒治疗方案的疗效与预后判断等具有重要意义。

HBV基因型具有地域分布差异性的特点，并且与慢性乙型肝炎疾病进展、抗病毒药物疗效及预后等因素密切相关。HBV基因型A、D主要分布于欧洲及非洲，基因型B、C主要分布于远东东部、亚洲等。本研究结果显示慢性乙型肝炎HBV基因型主要为C型和B型，经过拉米夫定治疗12个月后，基因型B慢性乙型肝炎发生YMDD变异率为35.53%，基因型C YMDD变异率为20.43%,表明基因型B的慢性乙型肝炎更容易发生YMDD变异。该研究结果与此前台湾学者的研究结果不一致，后者认为C基因型的YMDD变异率高于B基因型[8]。这可能与不同地区慢性乙型肝炎HBV基因型特点不一致相关。因此，在拉米夫定治疗前，对慢性乙型肝炎进行HBV基因型检测，将有助于判断患者出现拉米夫定耐药的可能性。

目前已有研究认为：YMDD变异与病毒因素、病毒和宿主相互作用密切相关[9]。本研究结果显示：YMDD变异组患者治疗前HBV DNA水平显著高于未发生YMDD变异组，即在拉米夫定治疗前，HBVDNA水平越高，YMDD变异出现的概率越高。这与Chang等[9]研究报道：HBV DNA水平与YMDD变异成正相关相一致。HBeAg阳性的慢性乙型肝炎YMDD变异率显著高于HBeAg阴性患者的YMDD变异率，提示治疗前HBeAg阳性的慢性乙型肝炎更容易发生YMDD变异。YMDD变异患者与未变异患者治疗前的ALT水平无统计学差异，说明在拉米夫定治疗前，慢性乙型肝炎的ALT水平与治疗后YMDD变异没有明显的相关性。但是，ALT作为一个非常重要的反映患者肝功能的指标，在拉米夫定治疗前、后必须及时动态监测。

总之，本研究提示拉米夫定治疗前慢性乙型肝炎患者的HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态与治疗后发生YMDD变异密切相关，其中基因型B、治疗前HBV DNA水平高、HBeAg阳性的慢性乙型肝炎更容易发生YMDD变异。因此，拉米夫定治疗前，检测HBV基因型、HBV DNA水平、HBeAg状态等指标对慢性乙型肝炎抗病毒治疗具有重要指导意义。

[1]Leung N W,Lai C L,Chang T T,et al．Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances hepatitis B e antigen seroconversion rates:results after 3 years of therapy [J]．Hepatology,2001,33(6):1527-1532．

[2]Liaw Y F,Chien R N,Yeh C T,et al．Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy[J]．Hepatology,1999,30(2):567-572．

[3]中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会．慢性乙型肝炎防治方案[J]．中华传染病杂志,2005,23(6):421-431．

[4]Usuda S,Okamoto H,Iwanari H,et al．Serological detection of hepatitis B virus genotypes by ELISA with monoclonal antibodies to type-specific epitopes in the preS2-region product[J]．J Virol Methods,1999,80(1):97-112．

[5]Pan X P,Li L J,Du W B,et al．Differences of YMDD mutational patterns,precore/core promoter mutations,serum HBV DNA levels in lamivudine-resistant hepatitis B genotypes B and C[J]．J Viral Hepat,2007,14(11):767-774．

[6]Lai C L,Chien R N,Leung N W,et al．A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B．Asia Hepatitis Lamivudine Study Group[J]．N Engl J Med,1998,339(2):61-68．

[7]Murata M,Furusyo N,Unno M,et al．Long-term effects of lamivudine treatment in Japanese chronic hepatitis B patients[J]．World J Gastroenterol,2011,17(24):2945-2952．

[8]Kao J H,Liu C J,Chen D S．Hepatitis B viral genotypes and lamivudine resistance[J]．J Hepatol,2002,36(2):303-304．

[9]Chang M L,Chien R N,Yeh C T,et al．Virus and transaminase levels determine the emergence of drug resistance during long-term lamivudine therapy in chronic hepatitis B[J]．J Hepatol,2005,43(1):72-77．

Factors related to HBV YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine treatment

Chronic hepatitis B Lamivudine YMDD mutations Relative factors Genotypes

2012-10-26）

（本文编辑：胥昀）

310003 杭州,浙江大学医学院附属第一医院超声科（朱少明、龚婷婷），药剂科（吴锋），感染科（朱彪）

【 Abstract】Objective To investigate the factors related to HBV YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy．Methods One hundred and sixty-nine chronic hepatitis B patients receiving lamivudine therapy for more than one year were retrospectively enrolled in the study．HBV genotypes,HBV DNA load,HBeAg status,and ALT levels were monitored prior to lamivudine treatment and at every three months during one year of lamivudine therapy．Results Of 169 patients,76 (44．97%)were infected with genotype B and 93 patients(55．03%)with genotype C．Total 46 patients(27．22%)with YMDD mutants were detected after one year of lamivudine therapy;there were significant differences in the rate of YMDD mutations between patients with genotypes B and C (35．53%vs 20．43%,P＜0．05)．The HBV DNA levels before treatment in patients with YMDD mutants were significantly higher than those in patients without YMDD mutants (7．26±0．58 vs 6．44±0．65 log copies/ml,P＜0．05)．Significant difference in the rate of YMDD mutations was observed between the patients with positive HBeAg and patients with negative HBeAg (38．10%vs 20．75%,P＜0．05)．No significant difference in the ALT levels were observed between the patients with YMDD mutants and without YMDD mutants(136．09±28．21 vs 124．15±26．52 U/L,P＞0．05)． Conclusion HBV genotypes,HBV DNA levels,and HBeAg status are strongly correlated with the emergence of YMDD mutations in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy．