β-arrestin基因表达对大鼠实验性急性胰腺炎重症化进程的影响

赵金锋 李钢 王凯诚 陈海平

β-arrestin基因表达对大鼠实验性急性胰腺炎重症化进程的影响

赵金锋 李钢 王凯诚 陈海平

目的 探讨急性胰腺炎重症化进程与β-arrestin基因抑制Toll样受体-白介素1受体（TLR-IL-1R）系统作用的相关性。 方法 建立SD大鼠实验性急性胰腺炎模型，分为假手术组（SO）、实验组（SAP）；以real-time PCR检测脾脏组织中β-arrestin mRNA的表达，Western blot和免疫组化检测肝脏组织TRAF6蛋白和胰腺组织中NF-κBp65蛋白表达。 结果 与SO组比较，SAP组β-arrestin mRNA表达受到显著抑制；TRAF6蛋白表达下降；NF-κBp65转录活性增强（P＜0．05或0．01）。 结论TLR-IL-1R系统可能参与急性胰腺炎重症化的病理过程。

急性胰腺炎 TLR-IL-1R β-arrestin

急性胰腺炎是临床常见急症，其预后与是否重症化相关，目前急性胰腺炎重症化的机制尚不清楚，但临床证据表明与失控的炎症反应相关。Toll样受体-白介素1受体（Toll-like receptor-IL-1 receptor，TLR-IL-1R）系统是天然免疫应答的关键信号通路，β-arrestin则是TLR-IL-1R系统的负调控因子。本研究试图探讨急性胰腺炎重症化进程与β-arrestin基因抑制TLR-IL-1R系统作用的关系。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级SD大鼠41只，雌、雄各半，体重（210± 10）g，购自浙江省实验动物中心（合格证号：SCXK＜浙＞2003-0001）。牛磺胆酸钠购自Sigma公司，RNA提取试剂盒（Trizol Reagent）为北京康为世纪生物科技有限责任公司产品，荧光-PCR试剂盒购于TaKaRa公司，βarrestin引物由北京康为世纪生物科技有限责任公司合成和提供，NF-κBp65亲和纯化兔多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，二步法免疫组化生物检测试剂盒（羊抗兔IgG二抗为丹麦DAKO公司产品），TRAF-6（D-10）一抗购于SANTA CRUZ公司、二抗购于北京中杉公司，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配制试剂盒是碧云天产品，小牛血清白蛋白购于BBI公司，聚偏氟乙烯膜为BIO-RAD公司产品。

1.2 实验分组和动物模型建立 实验动物按雌雄各半，随机分为假手术组（sham operation，SO）10只；实验组（severe acute pancreatitis,SAP）31只，制作急性胰腺炎模型。术前禁食12h，自由饮水，2.5%戊巴比妥钠（2ml/kg）腹腔注射麻醉；备皮、常规皮肤消毒、铺巾；由白线进腹。SAP组大鼠胰胆管逆向注射5%牛磺胆酸钠1ml/kg、速度0.2ml/min，注射毕停留4min后关腹；SO组仅模拟上腹部器官翻动[1]，实验终点为造模后24h，各组在实验终点采集标本。大鼠称重后，心脏采血，4℃下3 000r/min离心10min分离血清，置于灭菌试管中-20℃冰箱保存待测。分别取肝脏组织和脾脏组织约200mg，4℃下0.9%氯化钠溶液漂洗3次，滤纸吸干，-70℃冻存。胰腺组织以4%多聚甲醛固定、常规脱水、透明、包理、切片并HE染色。

1.3 检测方法 以real-time PCR检测脾组织中β-ar restin mRNA的表达[2]；Western blot检测肝脏组织中TNF受体相关因子 6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）蛋白水平[3]；二步法免疫组化检测胰腺组织中核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65蛋白表达[4]。

1.3.1 脾脏组织β-arrestin mRNA测定 脾脏组织总RNA提取按RNA试剂盒操作要求执行。各组抽样检测RNA纯度后，逆转录合成cDNA，-20℃冰箱中保存。靶基因β-arrestin mRNA引物序列：上游：5′-ATTTGCCTTGCTCCGTCACAC-3′；下游：5′-GGCTCGAATCTCAAAGTCTACTCCA-3′；内参三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物序列：上游：5′-AGAC-AGCCGCATCTTCTTGT-3′；下游：5′-CTTGCCGTG-GGTAGAGTCAT-3′。real-time PCR按试剂盒要求执行操作。循环条件：二步法，共40个循环，记录平均Ct值。结果处理按照2-ΔΔCT法：首先计算出每个标本的β-arrestin及内参基因GAPDH的Ct值，ΔCT=Ct（β-arrestin）-Ct（GAPDH），再按照ΔΔCT=ΔCT（SAP组）-ΔCT（SO组）算出β-arrestin在SAP组与SO组之间表达的差异。

1.3.2 肝脏组织TRAF6测定 将肝脏组织粉碎、裂解后提取蛋白，严格按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配胶，蛋白上样电泳、转膜，分次加一抗、二抗，置于BIO-RAD显影成像分析系统中显影成像。

1.3.3 胰腺组织NF-κBp65蛋白的表达 按试剂盒要求执行操作，切片厚度3～4μm。阳性判断：NF-κBp65阳性表现为胰腺腺上皮、导管上皮及胰岛部分细胞的胞浆和/或胞核呈棕黄色颗粒。结果评定标准：根据着色强度及着色细胞阳性范围进行计算。着色强度按未着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别记分为0、1、2、3分。着色细胞阳性范围：计数4个高倍视野，计算阳性细胞的比例；按0%、1%～29%、30～69%、70～100%分别记分0、1、2、3分。将每张切片着色强度与着色细胞阳性范围得分相加为其最后积分。

1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件，计量资料以表示。组间均值比较采用方差分析。

2 结果

2.1 一般情况 SAP组大鼠造模后不觅食，畏寒，皮毛疏松，腹部膨隆，而SO组大鼠无异常发现。实验终点SAP组存活10只，死亡率67.7%，死亡高峰出现在12h前后。SO组无死亡，两组间比较存在统计学差异（P＜0.05）。

2.2 病理学检查 大体观SAP组大鼠胶内有大量腹水肠管扩张，网膜组织和肾脂肪囊可见皂化斑，大鼠胰腺出现水肿、出血、坏死和皂化斑等，与临床上急性出血坏死性胰腺炎的表现相符。镜下观SAP组胰腺边界不清，小叶结构破坏，间质水肿明显，腺泡细胞水肿，呈岛状漂浮，腺腔扩张，胰腺组织广泛出血，大量中性粒细胞浸润，大片状腺体坏死及明显脂肪坏死和钙盐沉积。SO组大鼠无异常病理变化。

2.3 脾脏组织β-arrestin mRNA的表达 SAP组βarrestin mRNA表达受到抑制，与SO组比较有统计学差异（P＜0.01），见表1、图1-2。

图1 SAP组大鼠脾组织中β-arrestin mRNA的表达

图2 SO组大鼠脾组织中β-arrestin mRNA的表达

2.4 肝脏组织TRAF6蛋白表达 实验终点时SAP组TRAF6蛋白表达较SO组降低，具有统计学差异（P＜0.05），见表1、图3。

图3 TRAF6蛋白表达（A：SAP组TRAF6蛋白条带，1-10分别为SAP组大鼠编号；B：SO组TRAF6蛋白条带，1-10分别为SO组大鼠编号；C：内参β-actin条带）

2.5 胰腺组织NF-κBp65蛋白表达 实验终点时SAP组NF-κBp65蛋白表达升高，与SO组相比具有统计学差异（P＜0.05），见表1、图4。

表1 不同组别大鼠各指标的表达

图4 SAP组大鼠胰腺NF-κBp65蛋白高表达（免疫组化二步法，×400）

3 讨论

临床上一些患者的急性胰腺炎会重症化，而其中部分患者重症化的进程迅速，病情呈爆发性发展，十分凶险，病死率极高，确切的原因和机制尚不清楚[5]，但有证据表明急性胰腺炎重症化与机体自身失控的炎症反应有关。TLR和IL-1R构成的TLR-IL-1R系统是炎症时机体产生免疫应答和炎症反应的关键信号系统。NF-κB信号通路则参与机体免疫应答、炎症反应及细胞凋亡的基因表达的调控。TRAF6通过TLR-IL-1R系统调控NF-κB的活性。存在于细胞质中的β-arrestin在进化上非常保守，是TLR-IL-1R信号系统的负调控因子。βarrestin对不同的TLR无特异性，通过与TRAF6相互作用抑制TLR-IL-1R信号通路的传导。与大多数调控分子不同，β-arrestin的表达不受TLR信号的调控，但是β-arrestin与TRAF6之间相互作用却受到了TLR信号调控，β-arrestin与TRAF6之间的结合依赖于TLR-IL-1R信号通路的活化，因而β-arrestin与TRAF6之间的相互作用决定了β-arrestin对TLR-IL-1R信号通路的抑制作用[6-7]。这种调控一方面保证了有足够的天然免疫和炎症反应；另一方面也使机体避免了过度的免疫应答和炎症反应。

本研究中，在实验性急性胰腺炎的一定时相，SAP组大鼠大量死亡，这一时相相当于临床上SAP的重症化时期。同时Western blot检测提示TRAF6蛋白含量下降，提示TRAF6被泛素化修饰后，又被蛋白酶复合体降解；同步出现TLR-IL-1R信号通路的抑制因子β-arrestin基因表达的明显抑制，核转录因子NF-κB活性增强。实验证明，在迅速放大的炎症反应导致机体自我损伤，病情呈重症化发展的过程中，TLR-IL-1R信号系统作用强化。提示TLR-IL-1R信号系统参与急性胰腺炎重症化进程；在此进程中该信号系统的负调控因子βarrestin的基因表达受到明显抑制。

当机体面对严重的炎症性疾病如SAP时，限制TLR信号系统对于控制炎症反应的强度和持续的时间是十分重要的。在发病的早期，多样性/内源性TLR配体激活TLR信号，导致多种炎性细胞因子表达，如TNF-α和IL-6等，这些细胞因子本身也可以引起免疫应答，导致更多的细胞因子活化，使得炎症反应级联放大。本研究结果提示β-arrestin通过其与TLR-IL-1R信号系统中的关键分子TRAF6相互作用，抑制这种级联放大效应，把炎症反应控制在一定的程度，为阻止急性胰腺炎重症化的发展提供一定的治疗靶点。

[1]李钢,胡祖健,王凯诚,等．实验性重症急性胰腺炎对SD大鼠小肠防御素-5基因表达的影响[J]．肝胆胰外科杂志,2007,19(6):360-366．

[2]Gurevich V V,Gurevich E V,Cleghorn W M．Arrestins as multi-function signaling adaptors[J]．Handb Exp Pharmacol,2008, (186):15-37．

[3]Matsumura T,Degawa T,Takii T,et al．TRAF6-NF-kappaB path-way is essential for interleukin-1-induced TLR2 expression and its functional response to TLR2 ligand in murine hepatocytes[J]．Immunology,2003,109(1):127-136．

[4] Ginis I,Jaiswal R,Klimanis D,et al．TNF-α tolerance to ischemic injury involves differential control of NF-κB transactivation:the role of NF-κB association with p300 adaptor[J]．J Cereb Blood Flow Metab,2002,22(2):142-152．

[5]李钢,陈海平,沈海刚,等．中西医结合抢救APACHE-II42分的儿童爆发性重症胰腺炎[J]．浙江临床医学,1999,1(1):36-37．

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[7] 王梁华,司宇红,焦炳华．Toll样受体及其信号转导[J]．生物学与生物物理进展,2001,28(3):304-308．

Expression of β-arrestin gene in rats with experimental severe acute pancreatitis

Acute pancreatitis TLR-IL-1R β-arrestin

2012-04-25）

（本文编辑：胥昀）

杭州市科技发展计划医学重点专科专病项目（20070433 Q22）

310007 杭州，浙江中医药大学附属广兴医院（杭州市中医院）外一科

李钢，E-mail:ligang20030330@163.com

【 Abstract】Objective To investigate the expression of β-arrestin gene in rats with severe acute pancreatitis．Methods Experimental severe acute pancreatitis(SAP)was induced in SD rats．The expression of β-arrestin mRNA in splenic tissue was detected by real-time RT-PCR,the TRAF6 protein in liver tissue and NF-κBp65 protein in pancreatic tissue were assessed by Western blot and immunohistochemistry respectively．Results The expression of β-arrestin mRNA in splenic tissue was significantly inhibited;the expression of TRAF6 protein in liver tissue was decreased;and the transcriptional activity of NF-κB was increased in SAP rats．Conclusion Results indicate that the TLR-IL-1R signaling system may be involved in the pathological process of severe acute pancreatitis．