高效液相色谱法测定莲胆消炎片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量

陆 滢

（江苏省盐城市第一人民医院药剂科临床药学室，江苏 盐城 224000）

莲胆消炎片由穿心莲和苦木组方，功效为清热解毒、凉血消肿，用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、热淋涩痛[1]。根据1995年版《中国药典》1997年增补版本中对莲胆消炎片的标准，在其检查项中只对穿心莲内酯作了规定（即要求每片含总内酯以穿心莲内酯计，不得少于18 mg），未对脱水穿心莲内酯的含量作出规定，这样不易于对莲胆消炎片的质量进行有效控制[2]。笔者认为，可根据2010年版《中国药典(一部)》中对穿心莲的质量要求，建立用于莲胆消炎片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量测定的高效液相色谱法，从而控制莲胆消炎片的质量。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相测定仪；G1314B型紫外检测器；Agilent色谱工作站；BP 211D型电子天平；TB224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。穿心莲内酯对照品（批号为110797-200307），脱水穿心莲内酯对照品（批号为 110854-200306）均来自中国药品生物制品检定所；莲胆消炎片（批号分别为 20100101，20100309，20100716，20101103，20101201，江西恒康药业有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Agilent C18柱（150 mm × 4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 - 水（52 ∶48）；穿心莲内酯的流速：0．8 mL ／min，进样量：10 μL，检测波长：225 nm；脱水穿心莲内酯的流速：0．8 mL／min，进样量：10 μL，检测波长：254 nm。理论板数按穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰计算均应不低于2 000。

2．2 溶液制备

分别取穿心莲内酯对照品和脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含0．1 mg的混合溶液，即得对照品溶液（贮备液）[3]。取莲胆消炎片10片除去糖衣，精密称定，研细，取适量，精密称定1．0 g，置三角瓶中，精密加入40%的甲醇25 mL，称定质量，浸泡 1 h，超声处理（功率 250 W，频率 33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用40%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置中性氧化铝柱（200到300目，5 g，内径为1．5 cm），用甲醇15 mL洗脱，收集洗脱液，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：取不含穿心莲的模拟制剂制备的阴性对照品溶液，在上述色谱条件下进样测定。结果，在与穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品溶液峰相同位置，供试品溶液有色谱峰出现，色谱峰与其相邻峰能完全达到基线分离。阴性对照品溶液在穿心莲内酯和脱水穿心莲峰相应位置无干扰。高效液相色谱图见图1。

线性关系考察：精密量取穿心莲内酯对照品溶液（贮备液）适量共5份，分别置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀释定容，使质量浓度分别稀释 2，4，8，80倍，将上述 5份溶液和原对照品贮备液各精密量取10 μL注入色谱柱。以穿心莲内酯峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C，μg）为横坐标进行线性回归，得回归方程 C=26．395 030 12 A-13．301 027 15， r=0．999 9。结果表明，穿心莲内酯进样量在5～400 μg范围内与峰面积线性关系良好。平均回收率为97．74%。精密量取脱水穿心莲内酯对照品溶液（贮备液）适量共5份，分别置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀释定容，使质量浓度分别稀释 2，20，100，500倍，上述 5份溶液和原对照品贮备液各精密量取 10 μL注入色谱柱。以脱水穿心莲峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C，μg）为横坐标进行线性回 归，得 回归方程 C=17．341 648 01 A＋9．001 333 10，r=0．999 9。结果表明，脱水穿心莲内酯进样量在 3～1 535 μg范围内与峰面积线性关系良好。

图1 高效液相色谱图

精密度试验：精密吸取同一穿心莲内酯对照品溶液和脱水穿心莲内酯对照品溶液，分别连续重复进样5次。结果穿心莲内酯RSD为0．9%，脱水穿心莲内酯的 RSD为0．7%，表明该方法的精密度良好。

检测限考察：取穿心莲内酯对照品溶液（0．1 g／L）逐步稀释，在 S／N=10时，穿心莲内酯检测限约为 0．5 ng。取脱水穿心莲内酯对照品溶液（0．08 g／L）逐步稀释，在 S ／N=10 时，脱水穿心莲内酯检测限约为3．2 ng。

稳定性试验：精密量取含穿心莲内酯0．100 9 g／L的对照品溶液，按拟订方法操作，隔4 h测1次，共测5次，计算含量，结果的日内 RSD为0．47%。另取上述不同质量浓度的溶液，同法处理，周内重复测定3次，日间 RSD为0．89%。精密量取含脱水穿心莲内酯0．003 2 g／L的对照品溶液，按拟订方法操作，隔4 h测1次，共测5次，计算含量，结果的日内 RSD为0．39%。另取上述不同质量浓度的溶液，同法处理，周内重复测定3次，结果的日间RSD 为 0．91%。

2．4 样品含量测定

分别精密量取处理好的样品溶液10 μL注入色谱柱，测得样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积，由标准曲线方程计算莲胆消炎片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量，见表1。样品测定结果表明，莲胆消炎片中穿心莲内酯在穿心莲中的含量为1．39%，脱水穿心莲内酯在穿心莲中的含量为1．97%。该值符合2010年版《中国药典(一部)》限定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在穿心莲的含量不得少于0．8%的规定。

表1 莲胆消炎片含量测定结果（n＝6）

3 讨论

穿心莲的有效成分为二萜内酯类和黄酮类化合物，主要有穿心莲内酯，脱水穿心莲，新穿心莲内酯，去氧穿心莲内酯等成分[4]，具有细胞分化诱导、保肝降酶作用[5]，提高胆汁分泌量，并改变其物理特性等药理作用[6]。试验中收集了不同产地的穿心莲药材，并对其中的脱水穿心莲内酯的含量测定方法进行了研究，除超声时间增加到60 min外，测定方法和制剂测定方法都相同。用本法测定的5批药材的结果与1995年版《中国药典》中收载的薄层扫描测定结果比较，两种方法测定的结果差异不大。而不同批号药材的测定结果差异较大，鉴于大生产中的原材料受产地、来源、品种等因素的影响，使得制剂测定结果有较大差异，故对穿心莲材料中脱水穿心莲内酯的含量应该做限度规定[7]。

脱水穿心莲内酯易于溶解在有机溶剂中，对比了甲醇、乙醇和醋酸乙酯的提取效果，甲醇的提取所测得的含量高，故选用甲醇作为提取溶剂。同时根据文献[8]，以乙酸乙酯、甲醇为溶剂提取进行比较，结果因甲醇提取时间短，测定时杂质峰干扰少，故以甲醇提取时含量测定方法的回收率高、精密度好，重现性也好。

穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯分子极性较强，比较适合用于高效液相色谱分析，常用的流动相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系统、甲醇-水-氯仿 -二乙胺系统和甲醇-水-乙腈系统等。根据本品情况及查阅相关文献，甲醇可以满足穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯与杂质峰的分离，且得到较好的峰形。故选择了甲醇-水溶液（52∶48）作为流动相，得到了较好的分离效果。

文献报道穿心莲内酯在200～250 nm波长处有较大吸收[9]，用紫外分光光度与200～400 nm处扫描穿心莲内酯对照品溶液，结果显示在225 nm处有最大吸收峰，极限也较稳定。同样，脱水穿心莲内酯在254 nm处测定效果最佳。

有文献报道，穿心莲贮存年份越久，穿心莲内酯的含量则越低[10]。存放1年后，穿心莲内酯的含量可降低 50% ～80%。但另1篇文献报道，将新采收的穿心莲叶晒干并室温存放1年后，再测定穿心莲内酯的含量，结果与新采收时的含量基本一样，没有降低[11]。两种方法提示，穿心莲内酯含量的降低可能与其水分的含量成正比，这还需深入研究。

[1]王文采．中国植物志（第27卷）[M]．北京：科学出版社，1979：27．

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：化学工业出版社，1995：127．

[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：794．

[4]Matsuda T，Kuroyanacii M．Cell differentiutiorr inducing diterpents from Andrographis paniculata Nees[J]．Chem Pharm Bull，1994，42（6）：1 216．

[5]Kapil A，Koul IB，Banerjee SK，et al．Antiherpatotoxic effets of major diterpenoid constituentsofAndrogrophis paniculata[J]．Biochemical Pharmacology，1993，46（1）：182．

[6]Tripathi GS，Tripathi YB．Choleretic action of andrographolide obtained from Andrographispaniculata Nees[J]．Phytatherapy Research，1991，5（4）：176．

[7]王永林，陶 玲，周宝珠，等．高效液相色谱法测定消炎利胆胶囊中脱水穿心莲内酯的含量[J]．药物分析杂志，2000，1（20）：97．

[8]陈敏武，徐德然，王峥涛，等．RP-HPLC法测定不同产地及采收期的穿心莲内酯中穿心莲内酯和新穿心莲内酯的含量[J]．中国药科大学学报，1999，30（4）：291-293．

[9]孙春燕．高效液相色谱法测定消炎利胆胶囊中穿心莲内酯的含量[J]．中国中医药现代远程教育，2008，6（9）：187．

[10]陈敏武，徐德然，王 峥，等．消炎利胆胶囊中脱水穿心莲内酯的含量研究[J]．中国药科大学学报，1999，30（4）：131．

[11]金文姗，经 晶．HPLC法测定穿心莲及其提取物中穿心莲内酯的含量[J]．中药研究与信息，2001，3（8）：135．