壳聚糖对人子宫内膜癌细胞增殖及细胞周期的影响

张晓梅，潘 宇，魏 勉，顾方乐，吕 芳，孙 燕，董乃俊，王大新

（江苏省苏北人民医院，江苏 扬州 225001）

壳聚糖是由虾、蟹壳提取的高分子化合物几丁质经脱N-乙酰后衍生而成，具有良好的生物相容性和生物学活性，是一种新型的医用生物材料[1-2]。本试验旨在确定壳聚糖溶液在体外环境下对人子宫内膜细胞的影响，为壳聚糖作为节育器材料提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

RPMI-1640型培养基（Sigma公司）；胰蛋白酶（Difco公司）；FBS（Hyclone 公司）；MTT（Sigma 公司）。壳聚糖（剂型为干粉，济南海得贝海洋生物工程有限公司，商品名为脱乙酰医药级壳聚糖，生产批号为鲁卫食证字＜2007＞第370000-000052号）。人子宫内膜癌细胞Ishikawa细胞（上海复祥生物科技有限公司）Cell proliferation ELISA Kit（Roche），细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（碧云天公司）。

1．2 方法

细胞培养：在37℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养Ishikawa细胞，每2 d更换新鲜培养基。

壳聚糖溶液配制：取壳聚糖干粉2．0 g，加入蒸馏水100 mL，再加入冰醋酸1 mL，磁力搅拌24 h，待壳聚糖完全溶解后高速离心（10 000 r／min）20 min，取上清液，得质量浓度为 20 μg／μL 的壳聚糖溶液。

MTT检测细胞增殖：收集处于对数生长期的Ishikawa细胞，用培养基制成细胞悬液，接种于96孔板，1×104细胞／孔。24 h后加入质量浓度梯度的壳聚糖溶液，同时加入20%的FBS和5 μg／mL的阿霉素（DOX）溶液分别作为阳性对照和阴性对照，刺激48 h后加入 20 μL 的 MTT（5 g／L），继续培养 4 h，吸弃 MTT 溶液，每孔加入150 μL的 DMSO，震荡 10 min，使结晶物充分溶解，570 nm波长处，检测光吸光度。

BrdU检测DNA合成速率：收集处于对数生长期的Ishikawa细胞，用培养基制成细胞悬液，接种于96孔板，1×104个细胞／孔。24 h后加入质量浓度梯度的壳聚糖溶液，同时加入5 μg／mL的阿霉素作为阴性对照，刺激48 h后加入10 μmol／L的BrdU，孵育8 h后用Roche ELISA Kit检测BrdU吸光度。

流式细胞仪检测细胞周期：收集处于对数生长期的Ishikawa细胞，用培养基制成细胞悬液，接种于96孔板，1×104个细胞／孔。24 h后加入质量浓度梯度的壳聚糖溶液，同时加入5 μg／mL的DOX作为阴性对照，刺激48 h后收集细胞，70%乙醇4℃固定过夜，PI染色后上机检测。

2 结果

2．1 壳聚糖对Ishikawa细胞增殖的影响

为了检测不同质量浓度的壳聚糖对Ishikawa细胞生长的影响，分别用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的壳聚糖溶液刺激Ishikawa细胞 48 h，同时以 20%FBS和 5 μg／mL的 DOX处理 48 h作为阳性和阴性对照，用MTT检测细胞增殖情况。从图1可以看出，壳聚糖质量浓度低于 100 μg／mL时，对 Ishikawa细胞的增殖几乎没有明显影响（P＞0．05）；而壳聚糖质量浓度为 100 μg／mL时与对照组比较，Ishikawa细胞增殖能力显著增加（P＜0．05），同时阳性对照组20%FBS细胞增殖能力也显著增加（P＜0．05），而DOX处理组细胞增殖能力极显著降低（P＜0．01）。

图1 不同质量浓度壳聚糖对Ishikawa细胞增值的影响

2．2 壳聚糖对Ishikawa细胞DNA合成速率的影响

为了检测不同质量浓度的壳聚糖对Ishikawa细胞DNA合成速率的影响，分别用 0，0．01，0．1，1，10，50，100 μg ／mL 的壳聚糖溶液处理Ishikawa细胞48 h，同时用5 μg／mL的阿霉素处理48 h作为阴性对照，加入 1 μmol／L的 BrdU孵育 8 h，用 Roche ELISA Kit检测。从图2可以看出，低质量浓度的壳聚糖（不大于10 μg／mL）时，与对照组比较，试验组Ishikawa细胞的DNA合成速率没有显著性变化（P ＞0．05）；而壳聚糖质量浓度达到 100 μg／mL 时，对细胞 DNA的合成速率有显著的促进作用（P＜0．05）。同时，DOX处理组 DNA合成速率显著降低（P＜0．01）。

图2 不同质量浓度壳聚糖对Ishikawa细胞DNA合成速率的影响

2．3 壳聚糖对Ishikawa细胞周期的影响

为了检测不同质量浓度的壳聚糖对Ishikawa细胞周期的影响，分别用 0，0．1，1，10 μg／mL 的壳聚糖溶液刺激 Ishikawa 细胞48 h，同时用5 μg／mL的阿霉素刺激48 h作为阴性对照，收集的细胞用70%的乙醇于4℃固定过夜，随后PI染色，用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布。从表1和图3可以看出，≤10 μg／mL质量浓度壳聚糖对Ishikawa细胞的细胞周期几乎没有影响（P ＞ 0．05），即 0．1，1，10 μg／mL 质量浓度壳聚糖处理组的细胞G1期，S期以及G2期与对照组比较无显著性变化。而DOX处理组细胞无S期，同时G1期，G2期显著延长，与对照组比较有显著性差异（P ＜0．05）。

图3 不同质量浓度壳聚糖对Ishikawa细胞周期的影响

表1 不同质量浓度壳聚糖对Ishikawa细胞周期的影响(百分率／%)

3 讨论

壳聚糖是利用虾蟹外壳废弃物质制成的天然高分子化合物，具有良好的生物相容性，可在人体内完全吸收，无毒副作用，具有广阔的临床应用前景[3-4]。体外试验和动物试验表明，壳聚糖具有选择性抑制成纤维细胞、平滑肌细胞增殖和促进表皮细胞、内皮细胞的生长[5-7]，但对人子宫内膜细胞的影响尚未见文献报道。

在本研究中，首先通过MTT比色法检测了壳聚糖对Ishikawa细胞毒性的影响，发现仅当壳聚糖溶液质量浓度达到100 μg／mL时才能轻微地促进Ishikawa细胞的生长，而当壳聚糖质量浓度低于100 μg／mL时，对细胞的生长无明显的影响。同时，用BrdU掺入法来检测壳聚糖溶液对Ishikawa细胞DNA合成的影响，试验表明，壳聚糖溶液质量浓度高于50 μg／mL后，Ishikawa细胞DNA合成速率有轻微增加，但低于50 μg／mL时对DNA合成速率则无明显影响。MTT和BrdU试验结果中，壳聚糖影响Ishikawa细胞的最低质量浓度有所不同，其原因可能在于MTT比色法是从细胞水平来进行评价，而BrdU掺入法则是从分子水平来进行评价，故两种方法的灵敏度不同。综合考虑，选择不影响Ishikawa细胞生长的最低壳聚糖溶液质量浓度为10 μg／mL。最后，又用不同质量浓度的壳聚糖溶液处理Ishikawa细胞后，PI（碘化丙啶）染色，细胞流式仪检测细胞周期分布，其结果与前面结果一致，即当壳聚糖溶液质量浓度低于10 μg／mL时，对Ishikawa细胞周期没有明显影响。

综上所述，低浓度的壳聚糖溶液（≤10 μg／mL）对人子宫内膜癌细胞Ishikawa的生长、增殖、细胞周期都没有明显影响，这一特性使得壳聚糖可以作为宫内节育器的支架。

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