肌肽对高糖诱导的H9c2细胞损伤的拮抗作用*

师　岩,　齐晓丹，　张　伟，　张　帆，　宁小美，　李淑艳，　张春晶△

(齐齐哈尔医学院 1生物化学教研室， 4计算机教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006；齐齐哈尔医学院附属第三医院 2内分泌科， 3心胸外科，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

糖尿病已经成为危害人类健康的重要疾病之一，继发于糖尿病的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM) 是部分糖尿病患者发生心力衰竭和死亡的重要原因，严重影响患者的生活质量，因此对 DCM 患者的早期干预治疗有着重要的意义。2004年，美国糖尿病学会(American Diabetes Association, ADA)年会提出了糖尿病及其慢性并发症都有统一发病机制，即高血糖损伤的共同基础——氧化应激。氧化应激在 DCM 的发生发展中发挥重要作用，大量氧自由基及活性氧(reactive oxygen species,ROS)直接损伤心肌细胞及血管内皮细胞，引起细胞凋亡，最终表现为心肌细胞功能障碍[1-2]。因此抗氧化治疗成为防治糖尿病心肌病的一个有效途径。大量研究显示[3]，肌肽作为一种内源性的抗氧化剂,它具有水溶性好、性质稳定、分子量小、易于被机体利用等优点[4]。本实验以体外培养的大鼠心肌细胞H9c2为对象，建立高糖诱导心肌细胞损伤模型，观察肌肽拮抗高糖诱导的心肌细胞损伤及其作用机制，为肌肽在临床用于防治糖尿病心肌病并发症提供理论依据。

材　料　和　方　法

1材料

H9c2细胞由本实验室保存(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)；肌肽(Sigma)，胎牛血清(HyClone),0.25%胰酶-0.02%EDTA(吉诺生物医药技术有限公司),DMEM培养基(Gibco),DCFH-DA(Sigma)。活化caspase-8、caspase-9和caspase-3抗体(Abcam)。流式细胞仪(Becton)。Bio-Rad Gel-Doc凝胶成像系统。

2方法

2.1心肌细胞培养 H9c2细胞常规培养在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2条件下培养。

2.2实验分组及预处理方式 细胞分组：(1)正常对照组(NC组)：葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；(2)高糖损伤组(HG组)：葡萄糖浓度分别为20、25和30 mmol/L;(3)高糖+肌肽预保护组(Car+HG组)提前6 h加入浓度20 mmol/L肌肽预保护。

2.3MTT法检测细胞存活率细胞以2×104/well的密度接种于96孔培养板中，用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h，弃培养液，换不含血清的新鲜DMEM培养液培养6 h，使细胞同步化。分组给药同上，每组设6个平行孔，继续培养24 h、48 h和72 h后，加入50 μL新鲜配制的1 g/L MTT，37 ℃、5%CO2培养4 h后，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃轻摇10 min溶解紫色结晶。30 min内置酶标仪于490 nm波长下测定吸光度(A)。

2.4DCFH-DA探针检测ROSH9c2细胞用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，以(1.5～2)×108/L接种于60 mm培养板中。常规培养至75～80%，用不完全DMEM培养液培养48 h。细胞分组同上，每组3个复皿。在经过处理的细胞中加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃、5%CO2孵育20～30 min。细胞沉淀先用PBS洗2次，再用1 mL PBS液重悬细胞后收集至1.5 mL离心管中，然后用流式细胞术测定荧光强度，其激发波长为488 nm，发射波长为510 nm。

2.5Westem blotting检测蛋白表达收集并裂解细胞，提取蛋白。以等量蛋白上样进行SDS-PAGE。电泳结束后转移至 NC 膜上，5%脱脂奶粉37 ℃封闭90 min，抗活化caspase-8、caspase-9和caspase-3抗体4 ℃过夜孵育。1∶2 000 HRP-标记的抗体室温下孵育1 h，ECL Plus 检测。同时以GAPDH作内参照，采用Bio-Rad Gel-Doc凝胶成像系统对Western blotting结果进行分析。

3统计学处理

运用SPSS 16.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1肌肽对高糖诱导H9c2细胞存活率的影响

与对照组相比，不同浓度葡萄糖刺激24 h后，H9c2细胞的存活率差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。20、25和30 mmol/L葡萄糖处理48 h和72 h后，与24 h相比细胞存活率降低，随着高糖刺激时间和高糖浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1，提示细胞存活率具有时间、浓度依赖性。30 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，细胞存活率小于40%，25 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，细胞存活率约50%，提示25 mmol/L浓度能兼顾体现高糖导致的氧化应激损伤和适当的细胞死亡率，因此本实验选择25 mmol/L为常规高糖刺激组。高糖刺激72 h细胞死亡率过高，选择高糖刺激48 h，既可造成心肌细胞可逆性氧化应激损伤，又能较好反应抗氧化剂肌肽对心肌的保护作用。25 mmol/L葡萄糖刺激48 h并加入肌肽预保护的细胞中，细胞的存活率较其它高糖组显著提高，可由高糖损伤组的57.74%±2.43%增加到82.62%±2.61%，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 1. Effects of different concentrations of high glucose on the survival rate of H9c2 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control (NC) group.

图1MTT检测不同浓度高糖对H9c2细胞存活率的影响

2肌肽清除细胞内自由基的作用

流式细胞术检测结果见图2，25 mmol/L高糖刺激H9c2细胞48 h后细胞DCFH-DA的平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)(红色荧光)与正常对照组细胞(蓝色荧光)相比,荧光强度增加42.0%±3.2%，表示ROS水平明显增高(P<0.05)，而给予20 mmol/L肌肽后，荧光强度(绿色荧光)与高糖组细胞相比降低了35.0%±2.7%(P<0.05)，且与正常细胞相近，说明肌肽可明显抑制高糖引起的氧化应激反应。

Figure 2. Flow cytometry analysis of DCFH-DA fluorescence intensity. Normal control (NC) group:blue fluorescence; high glucose (HG, 25 mmol/L) group:red fluorescence; carnosine(Car, 20 mmol/L)+HG group:green fluorescence. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

图2流式细胞术检测高糖诱导H9c2细胞48h后细胞内DCFH-DA荧光强度

3Westernblotting分析肌肽对细胞caspase家族蛋白表达影响

Western blotting检测结果及灰度扫描后的目的条带与GAPDH比值见图3。高糖组与正常对照组相比, caspase-3相对含量(6.41±0.65vs2.21±0.53)、caspase-8相对含量(7.32±0.91vs1.15±0.49)和caspase-9相对含量(4.07±0.54vs0.51±0.31)均明显增多(P<0.05)。肌肽预保护组与高糖组相比，caspase-3相对含量(4.71±0.59vs6.41±0.65)和caspase-9相对含量(2.95±0.41vs4.07±0.54)均显著降低(P<0.05)，但caspase-8相对含量(7.64±0.89vs7.32±0.91)较高糖组无显著改变(P>0.05)。以上数据表明，高糖可诱导心肌细胞凋亡，而肌肽可通过下调caspase-9和 caspase-3蛋白表达水平而抑制凋亡。

Figure 3. Protein expression of activated caspase-3, -8 and -9 in H9c2 cells detected by Western blotting. A:normal control(NC) group; B:high glucose(HG,25 mmol/L) group; C: carnosine(Car,20 mmol/L)+HG group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

图3Westernblotting法检测活化caspase-3、-8和-9蛋白的表达

讨　　论

1972 年，Rubler 等发现糖尿病患者患有的特异性心肌病变，后被定义为DCM。该疾病包括了微血管病变和心肌细胞代谢紊乱引起的心脏病变。DCM是心肌对糖尿病的急性反应而导致的慢性病理改变，这些急性反应包括基因表达异常、信号转导改变及细胞凋亡[5]。H9c2细胞源于胚胎期大鼠心脏，保持很多心肌细胞的特征，可用于高糖的体外研究。我们以MTT法检测H9c2心肌细胞在不同高糖浓度、不同时点的细胞存活率，建立高糖诱导的细胞损伤模型组。研究证明，糖尿病心肌病的重要发病机制之一是高血糖损伤心肌细胞引起ROS生成增多[6]。Fiordalis等[7]在STZ诱导的糖尿病大鼠心脏标本中也发现，DCM增加心肌细胞凋亡的同时，心肌细胞内ROS增加了2倍以上，导致机体氧化应激加强。ROS所致的氧化应激是造成细胞凋亡的重要环节。我们通过DCFH-DA探针检测ROS，证明了高糖诱发心肌细胞损伤与氧化应激密切相关。近年来Mohammad等[8]证明了抗氧化剂在预防ROS引起的心肌细胞损伤方面可以发挥有益作用。肌肽作为一种内源性抗氧化剂，具有多种抗氧化作用，可以有效清除活性氧和自由基，对于改善与治疗2型糖尿病并发症有很好应用前景[9]，在防治糖尿病肾病、糖尿病视网膜病、糖尿病心血管病及糖尿病神经系统损害等方面已有报道[10]。我们曾发现：一定浓度的肌肽能有效抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，氧化应激在糖尿病血管病变中的损伤作用已得到证实[11]。为了进一步证明肌肽这种抗氧化剂在糖尿病心血管疾病中的作用，本实验以H9c2细胞为对象，建立高糖损伤模型，研究肌肽抑制高糖诱导的心肌细胞损伤作用及机制。糖尿病心肌病大鼠心肌细胞氧化应激损伤会导致细胞凋亡，其发生主要由2条信号通路介导，即外在途径和内在途径[12]。外在途径是死亡受体介导的信号通路，即胞外凋亡信号与膜上的凋亡受体相结合使caspase-8激活, 活化的caspase-8又激活caspase-3, 诱导凋亡的级联反应[13]；内在途径是线粒体介导的信号通路，即各种损伤因素通过促进线粒体释放细胞色素C等信号分子，然后激活caspase-9和caspase-3而介导细胞凋亡[14]。Caspase蛋白酶家族引发一系列级联反应，剪切底物使凋亡得以进行，在介导细胞凋亡中起着中心作用。迄今为止，已发现至少13种caspase家族成员参与了细胞凋亡，但在心肌细胞凋亡中以caspasc-3、-8和-9的作用最为重要。为了研究肌肽抑制高糖诱导的细胞损伤的作用，我们利用Western blotting方法重点检测了caspase家族蛋白中caspase-3、-8和-9的表达量。高糖诱导心肌细胞48 h后，高糖组中caspase-3、-8和-9均高表达。Bojunga[15]等人的研究同样认为，高血糖增加心肌细胞凋亡的过程中，增加了心肌Fas受体和caspase-8的表达，说明高糖诱导心肌细胞凋亡可以通过外在途径和内在途径2条信号通路。而肌肽预保护组的caspase-9和caspase-3表达量降低，caspase-8表达量没有明显变化,因此推测肌肽作用于高糖环境下的心肌细胞，可以通过线粒体信号通路介导抗氧化作用，抑制caspase-9和caspase-3表达，保护心肌细胞免受高糖诱导的氧化应激和凋亡损伤，而与外在途径死亡受体介导的信号通路关系不大。

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