MAPK通路抑制剂对三七皂苷单体R1减轻大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收缩的影响*

马迎春，　陈海娥,　王淑君，　黄林静，　何金波，　应　磊,2，　陈锡文，　王万铁,2△

(温州医科大学 1基础医学院病理生理学教研室， 2缺血-再灌注损伤研究所， 3实验动物中心，浙江 温州 325035； 4赤峰上京内分泌专科医院，内蒙古 赤峰 024000)

以往研究证实[1-3]，丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK；如p38MAPK和ERK1/2)信号通路介导了大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收缩(hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)及肺动脉高压的形成；三七总皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)可下调p38 MAPK及ERK1/2的表达，减轻肺血管收缩，降低肺动脉高压。PNS水解后即生成人参二醇型皂苷Rb1、人参三醇型皂苷Rg1、三七皂苷R1等。本室先前研究表明[4-5]，三七皂苷单体R1可能是PNS发挥降低肺动脉高压作用的主要成分之一。但是R1对HHPV有何影响及是否通过MAPK信号通路发挥效应，目前未见详细报道。本研究采用不同浓度三七皂苷单体R1及MAPK通路抑制剂在急性低氧高二氧化碳条件下处理离体SD大鼠二级肺动脉环，观察血管环收缩张力的变化，探讨三七皂苷单体R1对急性HHPV的影响及其与MAPK信号通路的关系。

材　料　和　方　法

1仪器设备

离体组织灌流浴槽(Panlab)；张力换能器(Panlab)；PowerLab 四道生理记录仪(AdInstruments)；GB303型自动电子天平(Mettler Toledo)；DSHZ-300恒温震荡水浴仪(江苏太仓实验设备厂)；AVL COMPACT3型血气分析仪(日本希森美康医用电子上海有限公司)；78-2型磁力搅拌器(江苏中大仪器厂)；413型pH计(Mettler Toledo)。

2药品和试剂

SB203580和U0126(Biosource)；二甲基亚砜(DMSO,上海申工生物技术有限公司)；重酒石酸去甲肾上腺素(上海禾丰制药有限公司产品)；乙酰胆碱(acetylcholine, ACh;Sigma)；三七皂苷单体R1(吉林大学天然药物研究室)；Kreb’s液：成份(mmol/L)为NaCl 18.4，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，NaHCO325，glucose 11, EDTA 8。EDTA与KH2PO4液预先配好，其余均在当天配好并按比例配成最终浓度。Kreb’s 液中诸试剂均为市售分析纯。

3实验过程

3.1制作二级肺动脉环Sprague-Dawley (SD)大鼠80只，体重(380±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号为SCXK(沪 2007-0005)。实验时颈椎脱臼法处死大鼠后，迅速开胸取出心肺，置于4 ℃ Kreb’s 液中迅速剪开右心室，剪除左右肺叶并洗净残血。然后快速、轻柔分离肺右侧二级肺动脉(注意不要过度牵拉血管和接触血管腔面以免损伤血管内皮)，制成 3 mm左右长的动脉环。动脉环穿过2个直径 0.2 mm 的三角形不锈钢小钩后，置于盛有 10 mL Kreb’s 液的恒温(37 ℃)离体血管灌注浴槽内，下端固定于槽底部，上端通过张力换能器与 PowerLab 四道生理记录仪相连，记录肺动脉环张力的变化。

3.2平衡肺动脉环、检测其内皮细胞预实验发现在本实验制备的二级肺动脉的最适前负荷为750 mg，调节张力微调器使最适前负荷在60 min内加至血管并维持平衡60 min，其间持续通入95%O2+ 5%CO2混合气体。达到平衡后的肺动脉环用NE(10-5mol/L)预收缩后观察ACh(10-5mol/L)的内皮依赖性舒张反应，若出现95%以上的舒张反应(舒张张力占同组NE收缩张力的百分数)视为内皮细胞完整，否则弃之不用。最后，冲洗血管环平衡30 min，记录平衡张力值P0。

3.3肺动脉环常氧反应性测定实验期间持续向浴槽内通入 95%O2+5%CO2混合气体，每隔 5 min记录1次平均张力值(P)，并计算张力变化率P%[(P-P0)/P0×100%]。

3.4肺动脉环低氧高二氧化碳反应性测定实验前用 92% N2+8% CO2的混合气体充灌 pH=7.35的K-H液(37 ℃)约40 min，将溶液瓶密闭，用血气分析仪监测 PO2及 PCO2使其分别稳定在 30 mmHg (4.00 kPa)和60 mmHg(8.00 kPa)。实验时将以上液体灌流入组织浴槽中形成急性低氧高二氧化碳模型。继续向浴槽液体中通入上述无氧气体并观察 60 min，注意浴槽加盖，使浴槽中的 K-H 液保持 PO2= 30～35 mmHg (4.00～4.67 kPa)，PCO2= 55～60 mmHg(7.33～8.00 kPa)。实验期间每隔 5 min记录平均张力值1次，并计算低氧高二氧化碳所致的张力变化率。

3.5观察大鼠肺动脉环对低氧高二氧化碳的反应及药物干预

3.5.1筛选R1最佳浓度肺动脉环随机分为：(1)常氧组(N组)；(2)低氧高二氧化碳组(H组)；(3) 低氧高二氧化碳+DMSO组(HD组)；(4)低氧高二氧化碳+R1组,该组又分为低浓度(RL组)、中浓度(RM组)和高浓度(RH组)亚组。

N组在常氧条件下记录血管环张力变化情况。其余各组按照低氧高二氧化碳反应性测定方法测定血管张力的变化。其中HD组、RL组、RM组和RH组，分别用DMSO (0.05%)、低浓度R1(8 mg/L)、中浓度R1(40 mg/L)和高浓度R1(100 mg/L)孵育肺动脉环20 min后，再用含上述等浓度药物的低氧高二氧化碳浴液灌注血管环。观察不同浓度R1对HHPV三期变化的影响，以筛选出R1缓解低氧高二氧化碳性肺血管收缩作用的最佳浓度。

3.5.2最佳浓度R1分别与SB203580及U0126联合孵育肺动脉血管环肺动脉环随机分为：(1)低氧高二氧化碳+ SB203580组(S组)；(2)低氧高二氧化碳+ U0126组(U组)；(3)低氧高二氧化碳+R1+SB203580组(RS组)；(4)低氧高二氧化碳+ R1+U0126组(RU组)。S组和U组分别用SB203580(10-5mol/L)和U0126 (10-5mol/L)孵育20 min 后按照以上相同方法测定血管张力的变化。RS组和RU组采用最佳浓度(8 mg/L)R1孵育肺动脉环20 min 后再分别用SB203580(10-5mol/L)和U0126(10-5mol/L)继续联合孵育20 min，之后在急性低氧高二氧化碳条件下观察HHPV 双向收缩反应的变化。

4统计学处理

采用 SPSS 17.0 统计软件分析，计量资料均进行正态性检验，实验数据(张力变化率)以均数±标准差(mean±SD)表示，n为肺动脉环数，多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间两两比较采用单因素方差分析，对每个相应的时点上每个分组之间的作用做两两比较。方差齐性者采用LSD法，方差不齐者进行Dunnet’s T3法检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结　　果

1低氧高二氧化碳对肺动脉环张力的影响

N组持续通入95%O2+5%CO2混合气体60 min，P%变化不明显。H组持续通入92%N2+8%CO2混合气体60 min，P%呈倒抛物线样变化；即在急性低氧高二氧化碳介质中，二级肺动脉呈现出双相性收缩变化：在急性低氧高二氧化碳1～5 min内出现短暂、明显的收缩峰(I期快速收缩峰)，5～15 min出现较明显的舒张(I期舒张)，15～20 min后出现缓慢、持久的收缩(II期持续收缩)，见图1。

急性低氧高二氧化碳条件下，H组二级肺动脉I期快速收缩峰最大张力变化率为(56.46±9.17)%，I期舒张最大张力变化率为(-23.87±7.62)%；II期持续收缩最大张力变化率为(62.14±8.09)%。与N组相比，急性低氧高二氧化碳引起的二级肺动脉双相收缩变化有显著差异(P<0.05或P<0.01)，见图2。

2R1在低氧高二氧化碳性肺动脉收缩中的作用

用不同浓度R1孵育二级肺动脉环20 min 后，再用含上述等浓度单体的低氧高二氧化碳浴液灌注血管环，结果显示，HD组和RL组HHPV的 I 期快速收缩明显缓解，II 期持续收缩逆转，RM组变化不明显，RH组HHPV的 I 期快速收缩和II 期持续收缩均增强，与HD组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。提示低浓度R1对缓解低氧高二氧化碳性肺血管收缩作用最佳，见图3。

3SB203580和U0126在R1缓解低氧高二氧化碳性肺动脉收缩中的作用

用最佳浓度(8 mg/L)R1分别与SB203580及U0126联合孵育肺动脉血管环，结果显示,在急性低氧高二氧化碳介质中，RS组和RU组收缩峰值较HD组均明显下降(P<0.05或P<0.01)，II 期持续收缩逆转为舒张状态。与RL组相比，RS组和RU组能显著缓解急性低氧高二氧化碳引起的肺动脉收缩,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与S组和U组相比，RS组和RU组能缓解急性低氧高二氧化碳引起的肺动脉收缩,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见图4、5。这提示MAPK通路抑制剂SB203580和U0126能加强低氧高二氧化碳条件下R1的血管舒张作用。

Figure 1. Dynamic changes of the secondary pulmonary artery ring tension under the hypoxia hypercapnia condition. Pulmonary arteries were exposed to acute hypoxia hypercapnia for 60 min, and a biphasic pulmonary artery contractile response (phase I acute vasoconstriction, phase I vasodilation and phase II persistent vasoconstriction) was observed.

图1低氧高二氧化碳下二级肺动脉环张力的动态变化

Figure 2. The effect of hypoxia hypercapnia (H) on the secon-dary pulmonary artery ring tension. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormoxia (N) group.

图2低氧高二氧化碳对二级肺动脉环张力的影响

讨　　论

一般认为低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的发生分为2个阶段：初期的低氧性肺血管收缩(hypoxia pulmonary vasoconstriction, HPV)和后期的肺血管结构重建[6-7]。虽然短期的HPV 对机体是一种保护机制，但长期反复发作的HPV却是肺动脉高压和肺源性心脏病的“元凶”；或者说是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺心病的始动因素，在COPD和肺心病的发生发展中发挥重要的作用。而长期缺氧引起的HPV、肺血管内皮功能失调和肺血管重构等最终会引起二氧化碳的潴留。多数学者认为：HPV发生于直径<300 μm的阻力性肺动脉，是单向持续性收缩反应，即HPV发生迅速，低氧环境下1 min内即可发生，此后数分钟内达到某一水平，并随低氧的存在而维持在此收缩水平。然而，本实验室先前研究发现[8]，二级肺动脉在急性低氧高二氧化碳条件下1 h内呈现出双相性收缩的变化，即I期快速收缩及舒张和II期持续性收缩。这一发现提示不同部位肺动脉收缩反应的机制可能并不相同。

Figure 3. Effects of low (RL), middle (RM) and high (RH) concentrations of R1 on hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group.

图3不同浓度R1在低氧高二氧化碳性肺动脉收缩中的作用

Figure 4. The effect of inhibition of MAPK on the rate of changes of the pulmonary artery ring tension under hypoxia hypercapnia. Under the acute hypoxia hypercapnia condition,both p38 MAPK inhibitor SB203580(A) and ERK1/2 inhibitor U0126(B) significantly attenuated the delayed, but not early contractile phase of the biphasic pulmonary artery contraction. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group;##P<0.01vsS group;△P<0.05,△△P<0.01vsU group.

图4MAPK通路抑制剂对低氧高二氧化碳性肺动脉环张力变化率的影响

Figure 5. The effects of SB203580 (A) and U0126 (B) on the flow-mediated vasodilation induced by the low concentration of R1. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group;*P<0.05,**P<0.01vsRL group.

图5SB203580和U0126对低浓度R1舒张血管作用的影响

我们之前的研究结果显示[8]：p38 MAPK抑制剂SB203580及ERK1/2通路抑制剂U0126均可明显缓解急性低氧高二氧化碳引起的二级肺动脉II期的持续性收缩，但I期快速收缩(有赖于细胞外钙离子存在)没有变化。杨光明等[9]研究表明，p38 MAPK和ERK参与了休克血管反应性和低氧血管平滑肌细胞收缩反应的调节，其机制与改变血管平滑肌肌球蛋白轻链磷酸化水平有关，可能通过钙敏感性调节途径来发挥作用。而p38 MAPK和ERK参与低氧高二氧化碳性肺血管收缩的机制尚需进一步探讨。

陈重华等[10]报道，三七皂苷单体R1能显著改善正常小鼠耳廓微循环并延长凝血时间，其机制是使细动脉和细静脉的血管口径显著增大，毛细血管开放数量明显增多。可能与其促进内皮细胞合成释放一氧化氮有关。本实验室先前研究[4-5]提示，三七皂苷单体R1可抑制低氧高二氧化碳诱导的肺动脉平滑肌细胞ERK1/2及p38 MAPK信号通路的活化。本实验中发现，低浓度三七皂苷单体R1(8 mg/L)可明显缓解HHPV的I期快速收缩，并能逆转II 期持续收缩，表明8 mg/L三七皂苷单体R1可以明显减轻急性低氧高二氧化碳性肺血管收缩；另外，低浓度R1+SB203580、低浓度R1+U0126联合孵育肺动脉血管环，发现HHPV的I期、II期收缩进一步得到逆转，提示抑制MAPK通路可能会加强急性低氧高二氧化碳条件下三七皂苷单体R1引起的二级肺动脉的舒张作用，但其具体机制尚需进一步探讨。实验研究中还发现，低浓度、高浓度三七皂苷单体R1分别具有减轻、增强低氧高二氧化碳性肺血管收缩的双向作用，提示不同浓度的三七皂苷单体R1可能抑制或激活不同的MAPK通路，进而影响血管收缩、舒张功能。有关不同浓度R1具有减轻或增强急性低氧高二氧化碳性肺血管收缩的作用机制及其与MAPK通路的关系，尚待深入研究。

综上所述，低浓度(8 mg/L)三七皂苷单体R1可减轻大鼠急性低氧高二氧化碳性肺血管收缩，其机制可能与MAPK(p38 MAPK和ERK1/2)信号通路的变化有关。

[参考文献]

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[2]朱阿楠，王淑君，王万铁，等．p38-MAPK信号通路在HHPH中的作用及三七总皂苷干预[J]．中国应用生理学杂志,2012,28(1):79-83．

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[4]唐兰兰，王淑君，黎关龙，等．三七皂苷单体R1对低氧高二氧化碳肺动脉平滑肌细胞ERK1/2表达的影响[J]．中国临床药理学与治疗学,2011,16(11):1216-1221.

[5]王淑君，刘立宾，黎关龙，等．三七皂苷单体R1抑制低氧高二氧化碳诱导的肺动脉平滑肌细胞p38 MAPK信号通路的活化[J]．中国病理生理杂志,2012,28(1):105-108．

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[8]朱阿楠，王万铁，林丽娜，等．MAPK通路抑制剂在低氧高二氧化碳性肺动脉收缩中的作用[J]．中国病理生理杂志,2008,24(8):1538-1542．

[9]杨光明，李涛，徐竞，等．ERK 和p38 MAPK升高MLC20磷酸化调节大鼠平滑肌低氧反应性[J]．基础医学与临床，2011,31(4):366-370．

[10] 陈重华，粟晓黎，张俊霞，等．三七皂苷R1、人参皂苷Rb1对微循环及凝血作用的影响[J]．华西医大学报,2002,33(4):550-552．