西洋参茎叶总皂苷减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤机制的研究*

王　琛,　刘　蜜,　王晓礽,　宋丹丹,　刘秀华△,　史大卓△

(解放军总医院 1中医科, 3病理生理研究室, 北京 100853； 2中国中医科学院西苑医院,北京100091)

西洋参茎叶总皂苷(Panaxquinquefoliumsaponins, PQS) 是西洋参茎叶中主要的活性成分。以往实验研究表明，PQS具有减轻缺血/再灌注(ische-mia/reperfusion, I/R)诱导的心肌细胞凋亡、心律失常和改善梗死后心室重构等作用[1-3]，其机制可能与增强抗氧化酶活性、维持细胞内Ca2+稳态等有关[4]。

研究表明钙超载是I/R发生的关键环节，钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是唯一依赖于Ca2+及钙调素(calmodulin，CaM)调控的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，参与多种细胞功能的调节[5]。PQS又具有维持细胞内钙稳态的作用[4]。我们研究证实PQS可以减轻离体培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤[6-7]。那么，PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制是否与CaN有关尚缺少研究，本部分工作利用乳鼠心肌细胞缺氧/复氧 (hypoxia/reoxygenation, H/R) 模型通过转染pCDB-CaN质粒或CaN特异性抑制剂FK506干扰CaN表达，以探讨PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制。

材　料　和　方　法

1动物与试剂

清洁级24 h内新生SD乳鼠，购自北京市军事医学科学院实验动物中心；PQS粉剂由吉林省集安益盛药业股份有限公司提供；细胞CaN活性比色法定量检测试剂盒购自GenMed；低糖DMEM干粉、购自Gibco；新生牛血清(new-born calf serum, NCS)购自PAA；胰蛋白酶购自Amresco；蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail)、苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、四甲基乙二胺(tetramethyl ethylene diamine，TEMED)、Tris碱、Tris-HCl、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)、考马斯亮蓝G250、过硫酸铵、甘氨酸、亮肽酶素和Triton X-100购自Sigma；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、β-巯基乙醇购自Merck；蛋白电泳分子量(7～175 kD)为Bio-Rad产品；兔抗人GAPDH单克隆抗体、兔抗人Bax、 Bcl-2和CaN多克隆抗体购自Cell Signal；辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG购自Santa Cruz；增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)试剂盒购自Millipore；脂质体Lipofectamine 2000及Opti-MEM购自Invitrogen；pCDB-CaN质粒由北京大学人类疾病基因研究中心构建；CaN抑制剂FK506购自Sigma。

2乳鼠心肌细胞培养

参照Simpson等[8]法加以改进，无菌操作取出生后24 h内SD新生乳鼠心尖部组织，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入适量0.15% 胰蛋白酶，37℃水浴下轻柔搅动、反复消化，制备心肌细胞悬液，差速贴壁。用含15% 新生牛血清的DMEM 培养液，调整细胞浓度为每瓶3×106个细胞，接种于底面积为75 cm2的培养瓶，置CO2孵箱进行原代培养。

3实验分组

取原代培养心肌细胞，置于CO2孵箱常规培养24 h，换无新生牛血清的DMEM培养液同步化24 h后，随机分组如下(进行4次原代培养，分别接种，n=4)：(1)正常对照(control)组：细胞置CO2孵箱37℃，常规培养至实验结束;(2)H/R组：按本室报道的方法[3]将细胞置于缺氧仓内，通入95% N2-5% CO2混合气4 h，更换37 ℃ 95%空气-5%CO2预平衡的10% NCS DMEM，37 ℃、5% CO2孵箱常氧继续培养12 h结束实验;(3)药物预处理(PQS+H/R)组：以PBS缓冲液稀释PQS原粉，配成浓度为160 g/L的储存液，过滤除菌，4 ℃保存，应用时将储存液1 000倍稀释加入心肌细胞培养液中，培养24 h，进行H/R操作;(4)CaN过表达+药物预处理(CaN+PQS+H/R)组：pCDB-CaN质粒转染6 h后，按照(3)组程序操作;(5)空载pCDB质粒+药物预处理 (pCDB+ PQS+H/R)组：空载pCDB质粒转染6 h后，按照(3)组程序进行操作；(6)CaN抑制剂+药物预处理 (FK506+PQS+H/R)组：培养基中加入FK506 (5 mg/L)，37 ℃预孵育10 min 后，按照(4)组操作。

4CaN过表达

以转染试剂Lipofectamin 2000转染pCDB-CaN质粒至乳大鼠心肌细胞，转染方法如下：(1)转染前1 d以104/cm2的密度接种，传代培养心肌细胞；(2)转染1 h前将细胞培养液换为Opti-MEM；(3)分别配制DNA-Mix和Lipo-Mix：将质粒或Lipofectamine 2000加入Opti-MEM，小心混合后于室温下静置6 min，而后将DNA-Mix与Lipo-Mix均匀混合，室温下静置20 min后小心滴加入细胞；(4)细胞继续培养5～6 h后换为正常的DMEM完全培养液继续培养至实验结束。

5心肌细胞凋亡率测定

实验结束时，收集各组细胞培养液，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化液制备单细胞悬液，按照测试盒方法分别加入染料Annexin V和propidium iodide (PI)，室温下孵育5～15 min，以流式细胞仪 (BD FACSCalibur， Becton-Dickinson) 检测细胞凋亡情况。

6心肌细胞CaN活性检测

细胞以每瓶3×105个细胞的浓度接种于25 cm2规格培养瓶，胰酶消化法收集细胞并加入3 mL预冷的GENMED清理液(Reagent A)，混匀细胞， 3 000×g4 ℃ 离心5 min，弃上清，加入500 μL GENMED裂解液(Reagent B)，充分混匀，转移至预冷的1.5 mL EP管中，强力涡旋振荡15 s后置于冰槽里孵育30 min，13 000 r/min 4 ℃ 离心5 min，收集上清液，移取10 μL进行蛋白定量，余样本即可放进-80 ℃冰箱保存或置于冰槽里参照试剂盒操作说明进行CaN活性测定。

7Westernblotting分析

按本室报道方法[9]提取心肌细胞总蛋白，Bradford法蛋白定量后分装，-80 ℃保存。取上述细胞蛋白提取液上清 (含蛋白80 μg) 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE，12%分离胶)，将电泳分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，用5%BSA封闭40 min后分别加入Bcl-2、Bax、CaN多克隆抗体(均为1∶500) 4 ℃过夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相应的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH (1∶500) 单克隆抗体重复上述实验过程，作为上样对照。化学发光ECL显示，采用Image-Pro Plus软件分析蛋白条带的积分吸光度值 (integratedAvalue，IA， 平均吸光度值×面积)，以靶蛋白/GAPDHIA比值反映靶蛋白水平。

8统计学处理

采用SAS 8.2统计软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD) 表示，采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 进行多组间比较，采用q检验进行多组间两两比较，两变量相关性采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1CaN表达对PQS心肌细胞保护作用的影响

1.1心肌细胞凋亡率正常对照组细胞生长状态良好，凋亡率为2.0%；CaN过表达组心肌细胞凋亡率为6.6% (P<0.05)；以160 mg/L浓度的PQS预先培养24 h，细胞凋亡率为3.1%，与PQS+H/R组比较，CaN过表达组细胞凋亡率升高3.5% (P<0.05)；FK506对于PQS改善H/R后心肌细胞凋亡率无明显影响，与PQS+H/R组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

Figure 1. Flow cytometry analysis of the effect of CaN on cardiomyocyte apoptosis. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

图1流式细胞术分析CaN对心肌细胞凋亡的影响

1.2凋亡相关因子蛋白表达采用Western blotting检测凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达变化，结果显示：转染CaN质粒后，与PQS+H/R组相比，Bcl-2蛋白表达降低50.0%，而Bax蛋白表达为PQS+H/R组的2.0倍 (P<0.05)；FK506对于PQS改善H/R后心肌细胞凋亡相关因子蛋白表达无明显影响，Bcl-2和Bax蛋白表达与PQS+H/R组比较无显著差异(P>0.05)，见图2。

2PQS对心肌细胞CaN活性及蛋白表达的影响

2.1心肌细胞CaN活性测定采用比色法测定CaN活性，结果显示,H/R诱导CaN活性明显增加，为对照组的10.0倍 (P<0.05)。PQS明显抑制H/R引起的CaN活性升高，较H/R 组降低70.6%(P<0.05)；转染CaN质粒后，与PQS+H/R组比较，CaN活性升高3.0倍 (P<0.05)；FK506对于PQS改善H/R后心肌细胞CaN活性无明显影响，与PQS+H/R组比较无显著差异 (P>0.05)，见图3。

2.2心肌细胞CaN蛋白表达采用Western blotting检测CaN蛋白表达变化，结果显示， H/R诱导CaN蛋白表达明显升高，为对照组的3.0倍 (P<0.05)。

Figure 2. Effects of calcineurin on the expression of Bcl-2 and Bax in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

图2CaN对心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Figure 3. Effect of PQS on CaN activity in cardiomyocytes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

图3PQS对心肌细胞CaN活性的影响

PQS明显抑制H/R引起的CaN蛋白表达升高，较H/R 组降低60.9% (P<0.05)；转染CaN质粒后，与PQS+H/R组比较，CaN蛋白表达升高2.3倍(P<0.05)；FK506对于PQS改善H/R后心肌细胞CaN蛋白表达无明显影响，与PQS+H/R组比较无显著差异(P>0.05)，见图4。

讨　　论

近年来随着临床冠脉内溶栓术、经皮冠脉腔内血管成形术及冠脉搭桥术等治疗方法的广泛应用，心肌再灌注损伤愈来愈引起人们的重视。I/R损伤指缺血一定时间的心肌恢复灌流后，组织损伤反而进行性加重，心肌细胞从可逆损伤转变为不可逆损伤的现象。I/R发生的主要环节是氧自由基产生和钙超载，其机制尚未完全阐明，CaN是唯一依赖于Ca2+调控的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。CaN在细胞增殖、分化、凋亡及其它病理过程中起着重要作用，参与心肌肥大、心肌凋亡、血管平滑肌细胞增殖等过程的调节。心肌细胞坏死和凋亡是心肌I/R损伤的特征之一[10]。Musat-Marcu等[11]在离体灌流大鼠心脏上发现，再灌注早期即可发生心肌细胞凋亡。其中抗凋亡基因bcl-2与促凋亡基因bax参与了心肌I/R损伤中细胞凋亡的调控[12]。研究证明I/R时胞浆内Ca2+浓度升高，引起CaN活化，通过Bad(Bcl-2家族促凋亡因子)去磷酸化拮抗Bcl-2的抗凋亡功能，促进细胞凋亡[13]。Bueno等[14]发现CaNAβ基因打靶小鼠易致急性缺血诱发的心肌凋亡，从而推测CaN信号途径可介导心肌细胞凋亡；Singh等[15]发现I/R时，肾素-血管紧张素系统被激活，释放大量儿茶酚胺，可通过β1受体介导细胞凋亡；李文霞等[16]发现CaN过表达可以增加I/R损伤心肌细胞凋亡率。Ikeda等[17]与Nathan等[18]研究证实，心肌与脑I/R损伤均可导致CaN活性增强，促进细胞凋亡，导致心肌损伤，以CaN抑制剂CsA抑制其活性及表达可对I/R产生保护作用。

Figure 4. Effect of PQS on CaN protein expression in cardiomyocytes. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R;&P<0.05vsPQS+H/R.

图4PQS对心肌细胞CaN蛋白表达的影响

本研究利用乳鼠心肌细胞H/R模型，采用流式细胞术以及Western blotting方法，证实外源性CaN过表达后能明显增加心肌细胞凋亡率，升高促凋亡蛋白Bax表达及降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达，提示CaN具有促心肌细胞凋亡作用，与文献报道一致[19-20]，课题组前期实验证实PQS能明显减轻H/R诱导的心肌细胞损伤和凋亡，本研究表明联合给予CaN抑制剂组与单纯PQS预处理组一样均能降低心肌细胞凋亡率，但2组相比无明显差异，提示CaN活性抑制可以减少心肌细胞凋亡，但并未加强PQS对H/R心肌细胞的保护作用。 本研究按CaN测试盒步骤测定心肌细胞CaN活性，以Western blotting方法，检测心肌细胞CaN表达，发现H/R诱导CaN活性及蛋白表达明显增加，PQS明显抑制H/R引起的CaN活性升高及蛋白表达，单纯PQS预处理组与联合给予CaN抑制剂组均能降低心肌细胞CaN活性及蛋白表达，但2组相比无明显差异，提示CaN活性抑制对于PQS改善H/R后心肌细胞CaN活性及蛋白表达无明显影响。

综上所述，心肌细胞H/R损伤可以导致CaN活性及蛋白表达增加，增加心肌细胞凋亡，FK506抑制CaN活性可以减轻心肌细胞H/R损伤，CaN活性抑制对心肌细胞的保护作用不比单独应用PQS强，提示PQS减轻心肌细胞H/R损伤的机制可能与CaN途径无关。

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