大鼠体外循环后血浆二胺氧化酶与小肠黏膜基质蛋白变化的相关性研究

商宏伟，孙盛斌，肖颖彬，刘 梅

·基础研究·

大鼠体外循环后血浆二胺氧化酶与小肠黏膜基质蛋白变化的相关性研究

商宏伟，孙盛斌，肖颖彬，刘 梅

目的探讨大鼠体外循环（CPB）后血浆二胺氧化酶活性与小肠黏膜细胞外基质蛋白变化的相关性，为阐明CPB后肠黏膜屏障损害的发生机制提供依据。方法健康成年雄性清洁级SD大鼠40只，随机分为CPB组（n＝20）和假手术组（n＝20），另取10只作为正常对照组。应用大鼠CPB模型进行操作并于转流结束后取血液标本及小肠组织标本，分光光度法测定血浆二胺氧化酶活性，免疫组化、放射免疫法和天狼星红苦味酸染色法测定小肠组织层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原构成及含量变化，并进行统计学分析。结果CPB组血浆中二胺氧化酶活性比假手术组和正常对照组显著增高（P＝0.018）；免疫组化显示CPB组小肠组织中层粘连蛋白和Ⅳ型胶原蛋白表达下降，出现上皮基底膜变薄，部分出现断裂消失，含量明显低于假手术组和正常对照组；CPB组小肠间质中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原相间排列紊乱交错，Ⅰ型胶原减少明显。图像分析表明CPB组小肠组织胶原容积分数明显减少，而假手术和正常对照组之间无显著差异。线性回归及相关分析结果CPB后小肠黏膜层粘连蛋白、Ⅳ型胶原含量、胶原容积分数与血浆二胺氧化酶活性呈显著的负相关。结论CPB后肠黏膜细胞外基质各成分含量下降与结构破坏是肠黏膜屏障功能损害的重要因素之一。

体外循环；大鼠；细胞外基质；肠黏膜屏障

肠黏膜屏障是指肠道能够阻止肠内有害物质如细菌和毒素等穿过肠黏膜进入人体其他组织、器官和血液循环的一种结构和功能总和。正常的肠屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障共同构成。已有研究表明体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）术后早期即可出现肠黏膜屏障功能的损害，是造成CPB后肠源性感染和系统性炎症反应（systemic inflammatory response，SIRS）发生发展的重要原因之一［1］。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）与上皮细胞相互作用是损伤后黏膜修复与重建的重要因素［2-3］，而CPB引起的肠黏膜细胞凋亡可能是导致肠屏障功能受损肠源性感染的细胞学基础。但是CPB后肠黏膜ECM变化及其在肠屏障功能中的作用还未确定。本研究旨在观察CPB后肠黏膜上皮基底膜层粘连蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型胶原和间质中Ⅰ、Ⅲ型胶原构成及含量变化，探讨其与肠屏障功能障碍的相关性，为阐明CPB后肠黏膜屏障损害的发生机制和探索CPB肠黏膜屏障保护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 大鼠CPB模型［4-5］：

1.1.1 实验动物 成年健康雄性清洁级SD大鼠由第三军医大学实验动物中心提供，体重350～500 g。术前6 h禁食水。

1.1.2 仪器设备 CPB滚压式血泵（丹麦polystan A/S，Denmark），配套硅胶泵管内径4 mm。大鼠专用膜式氧合器（表面积0.10 m2）和热交换器均由西安西京医疗器械公司定制；变温水箱（Sarns，Ann Arbor，Michigan，美国）。转流管道由硬塑料管组成、颈静脉插管为18G一次性静脉留置针（BD Intima-Ⅱintegrated catheter），平均动脉压（MAP）和动脉灌注插管均为24G的一次性静脉留置针。20 ml注射器作为静脉贮血器。表式血压计改装后用于监测MAP，连接管道以微量泵注射器延长管代替，温度计测定肛温。气管插管由8号婴儿胃管代替；小动物呼吸机为浙江大学医疗仪器厂产品。

1.1.3 预充 预充液总量25 ml，成分：新鲜的同种大鼠血液10～15 ml、血定安6 ml、乳酸林格氏液4 ml、5%碳酸氢钠1 ml、20%甘露醇1 ml、肝素钠300 IU/kg。

1.1.4 手术方法 术前30 min阿托品0.03 mg/kg皮下注射。10%乌拉坦溶液10 ml/kg腹腔注射麻醉，手术过程中根据情况追加。大鼠仰卧固定于实验操作台上。气管切开插管，呼吸机吸入氧浓度为21%，呼吸频率60次/min，吸呼比为1∶2，潮气量16～20 ml/kg。经左侧股动脉插入24G留置针后接动脉测压表；再游离出左颈动脉、颈静脉，远端结扎。经过左股动脉测压管注射肝素钠300 U/kg使全身肝素化。采用24G静脉留置针经左颈动脉逆行插入作为动脉灌注管；经左颈静脉将18G静脉留置针穿刺直至右心房水平作为静脉引流管。连接泵管后开始转流。转流开始时灌注流量约为35 ml/（kg· min），逐渐增加到约90～120 ml/（kg·min），平均流量为（85.0±12.5）ml/（kg·min）。转流开始后停止呼吸机辅助呼吸，氧合器供氧（FiO2为100%），氧流量与灌注流量比值保持在0.8～1.0。转流过程中MAP保持在60～80 mm Hg。转流稳定后将肛温逐渐降至约32.0℃，转流60 min后逐渐复温，直肠温度达到约37.0℃后停止CPB。恢复机械通气，待自主呼吸稳定后撤离呼吸机。总转流时间（75±9）min。

1.2 实验分组 随机分为CPB组（n＝20）、假手术组（SH组，仅在各部位进行插管操作，不转流，n＝20）和正常组（N组，n＝10）。

1.3 标本留取及处理 CPB结束后2 h处死动物，无菌条件下取肠系膜上静脉血分离血浆-70℃保存待测；取距回盲部5 cm的回肠肠段2 cm，按黎君友［6］方法进行肠组织匀浆，-70℃保存；另取肠段2 cm，作病理分析。

1.4 指标测定 按照黎君友等［6］建立的分光光度法测定血浆二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性；由于CPB使用的血液稀释对各指标浓度的影响，用以下公式校正：校正值＝测定值×转流前红细胞比容（Hct）/测定时Hct。放射免疫法测定回肠组织匀浆中LN、Ⅳ型胶原含量，试剂盒购自上海海军医学研究所，按说明书操作。免疫组化和天狼星红苦味酸染色法分别进行肠组织LN、Ⅳ型胶原和Ⅰ、Ⅲ型胶原染色，偏振光显微镜下可见Ⅰ型胶原呈红黄色、Ⅲ型胶原呈绿色。采用DT2000型形态图像分析软件V2.0进行拍照分析，计算小肠黏膜胶原容积分数（collagen volumn fraction，CVF），CVF＝小肠黏膜胶原面积/所测术野总面积，所有标本随机取5个视野测量，取平均值。

2 结 果

2.1 血浆DAO活性变化 见图1。

图1 实验结束时DAO活性

2.2 小肠黏膜LN和Ⅳ型胶原变化 ①免疫组化结果显示：与对照组相比，CPB大鼠小肠黏膜中层LN和Ⅳ型胶原蛋白表达下降，上皮基底膜变薄，部分断裂消失，见图2、3。②定量分析：放射免疫结果显示大鼠小肠黏膜组织匀浆中层LN和Ⅳ型胶原含量在CPB后明显下降，显著低于假手术组和正常对照组，见图4。

2.3 小肠黏膜Ⅰ、Ⅲ型胶原含量变化 天狼星红苦味酸染色偏振光显微镜下胶原定性结果显示：正常对照组和假手术组小肠黏膜染色和间质性细胞外间质中Ⅰ型胶原（红黄色）、Ⅲ型胶原（绿色）相间排列整齐，含量丰富，呈条索状；CPB组可见条索状的染色明显减少，排列紊乱交错，红黄色的Ⅰ型胶原减少明显，见图5。

与正常对照组和假手术组比较，CPB组小肠组织小肠黏膜胶原容积分数明显减少，而假手术组和正常对照组之间无显著差异，见图6。

2.4 小肠黏膜ECM变化与血浆DAO活性的相关性线性回归及相关分析结果CPB后小肠黏膜层粘连蛋白、Ⅳ型胶原含量、小肠黏膜胶原容积分数与血浆DAO活性呈显著负相关。见图7。

图2 小肠黏膜组织层粘连蛋白表达（×200）

图3 小肠黏膜Ⅳ型胶原蛋白表达（×200）

图4 实验结束时LN和Ⅳ型胶原含量定量分析

图5 实验结束小肠黏膜天狼星红染色（×200）

图6 实验结束时小肠黏膜CVF

图7 肠黏膜LN、Ⅳ型胶原含量、CVF与血浆DAO活性关系

3 讨 论

CPB过程中血液重新分布，以大脑为代表的主要脏器血流基本不变，而腹腔脏器血流骤然减少，加上CPB过程的血液稀释，肠道处于低氧、低压、低灌注状态。CPB时肠道屏障功能易受到破坏与肠道特有的组织结构有关，由于特殊的血管解剖学和“逆流交换机制”（countercurrent exchange mechanism），即小动脉以直角方式进入绒毛，边扩散氧边走行至绒毛尖部，造成绒毛尖部氧分压低于基底部。在小肠血流减少时逆流交换机制亢进，从而使黏膜遭受缺血打击，而肠绒毛顶部是对局部缺氧最敏感最易受打击的部位。研究发现CPB引起肠黏膜损伤的组织学特征是小肠部分绒毛水肿、片状坏死、脱落，固有层血管充血、中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润、柱状上皮坏死，部分绒毛断裂、脱落，结果表明CPB后肠上皮细胞完整性和细胞骨架发生改变，是造成肠屏障功能变化的物质基础，并证实肠上皮细胞凋亡在CPB后肠屏障功能损害中起重要作用［2，5，7-8］。但是对于小肠黏膜ECM成分变化在屏障功能障碍发生中作用的研究鲜有报道。

DAO是所有哺乳动物肠黏膜上皮绒毛细胞胞浆中具有高度活性的细胞内酶。DAO不但能够反映肠黏膜完整性和损伤程度，而且能通过无创性测定外周血中DAO活性变化来反映肠黏膜状态，是反映小肠黏膜机械屏障的完整性和损伤程度较为理想的指标［1，7，9］。本实验结果显示：CPB组血浆DAO活性明显升高，提示CPB后肠黏膜完整性破坏，肠屏障功能已经受损。

肠黏膜上皮细胞基底面与深部结缔组织之间共同形成的薄膜称为基底膜，构成基底膜的主要成分是LN、Ⅳ型胶原和硫酸肝素蛋白多糖等。基底膜下面是间质性ECM，富含有Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维LN和多种糖蛋白等。生理状态下基底膜除了具有支持、连接和固着作用外，还有利于上皮细胞与深部组织间的物质交换。新近研究表明基底膜还可以引导上皮细胞移动，影响细胞的增殖和分化。肠黏膜屏障的重要基础是肠上皮细胞和基底膜结构与功能的完整性和稳定性。肠黏膜ECM与上皮细胞之间的相互作用是损伤后黏膜修复的重要因素［1］。有关ECM对于肠屏障功能的影响可以从以下方面考虑：①ECM成分参与细胞的连接、信号传递，是细胞赖以生存的重要基础［1，9-10］；②间质性ECM成分Ⅰ、Ⅲ型胶原含量变化可使得肠黏膜正常形态发生变化，如肠绒毛内微血管、乳糜管和各种纤维网状结构发生改变引起功能障碍，而不是通过促进细胞凋亡的途径造成屏障功能的损害。

本研究表明CPB后大鼠小肠黏膜上皮基底膜LN和Ⅳ型胶原表达明显减少，基底膜出现变薄、断裂或缺如。间质性ECM中Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解增加，含量下降。CPB后小肠黏膜LN、Ⅳ型胶原含量、CVF与血浆DAO活性呈显著的负相关。其中LN和Ⅳ型胶原含量与血浆DAO活性相关性更显著，提示CPB后肠黏膜ECM各成分含量下降与结构破坏是肠屏障功能损害的重要因素之一。术后监测血浆DAO活性对于肠黏膜功能监测和保护有重要意义。

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Study on the correlation between plasma diamine oxidase activity and the changes of extracellular matrix of intestinal mucosa in rats after cardiopulmonary bypass

Shang Hong-wei，Sun Sheng-bin，Xiao Ying-bin，Liu Mei
Department of Cardiothoracic Surgery，PLA 254 Hospital，Tianjin 300142，China

ObjectiveTo study the correlation between plasma diamine oxidase activity and the changes of extracellular matrix（ECM）of intestinal mucosa in rats after cardiopulmonary bypass（CPB）.MethodsCPB model in rats was established.40 SD rats were randomly divided into CPB group（n＝20）and sham-operation（SH）group（n＝20），another 10 SD rats were taken as normal control（N）group.The plasma diamine oxidase（DAO）activity was measured by spectrophotometry，and the ECM component laminin（LN）and typeⅠ，Ⅲ，Ⅳcollagens of intestinal mucosa were measured by immunohistochemsitry，radioimmunology and picrosirus red stained respectively.ResultsThe plasma DAO activity in group CPB（1.817±0.359 U/ml）was significantly higher than those in group SH and N（P＝0.018），while the contents of intestinal mucosa of LN and typeⅣcollagen in group CPB were obviously decreased compared with those in group N and SH.It showed that the epithelial basement membrane of intestinal mucosa became thinner，partly ruptured and even disappeared by immunohistochemistry in group CPB.Type I and III collagens arranged interphasely but in disorder in group CPB，especially the type I collagen was significantly decreased.The collagen volume fraction（CVF）was significantly decreased in group CPB compared with group SH and N，but there is no difference between group SH and N.The changes of LN and typeⅠ，Ⅲ，Ⅳcollagens in the intestinal mucosa in group CPB were significantly negatively correlated with the activity of plasma DAO by linear correlative analysis.ConclusionThe contents decrease of the components of ECM and the disorganization in intestinal mucosa were the important factors of intestinal barrier dysfunction after cardiopulmonary.

Cardiopulmonary bypass；Rats；Extracellular matrix（ECM）；Intestinal barrier

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0111-05

2012-10-23）

2013-02-17）

300142天津，解放军第254医院心胸外科（商宏伟、孙盛斌）；400037重庆，第三军医大学附属新桥医院心血管外科（肖颖彬、刘 梅）