不同的体外循环温度和方法对婴儿外周血CD34+/c-kit+干细胞表达的影响

江 淦，徐志伟

·临床研究·

不同的体外循环温度和方法对婴儿外周血CD34+/c-kit+干细胞表达的影响

江 淦，徐志伟

目的研究浅低温（MH）、深低温停循环（DHCA）和深低温停循环加选择性脑灌注（DHCA+SCP）三种转流方法对先天性心脏病婴儿外周血CD34+/c-kit+干细胞表达变化的影响。方法33例先天性心脏病手术患者分为：10例MH组，10例DHCA组和13例DHCA+SCP组。分别于转流前（T0）、转流结束后12～24 h（T1）、转流结束后4～5 d（T2）测定外周动脉血中CD34+/c-kit+干细胞含量变化。结果T0：MH组、DHCA组和DHCA+SCP组患者外周血CD34+/c-kit+干细胞含量无显著差异（P＞0.05）；T1：DHCA组CD34+/c-kit+干细胞含量显著高于MH组和DHCA+SCP组（P＜0.01）；T2：DHCA组CD34+/ckit+干细胞含量也显著高于MH组以及DHCA+SCP组（P＜0.01）。结论DHCA方法与MH和DHCA+SCP方法相比会导致外周血CD34+/c-kit+干细胞表达的升高，可能存在不同程度骨髓向外周血动员修复，为提高临床治疗效果提供新思路。

浅低温；深低温停循环；选择性脑灌注技术；外周血CD34+/c-kit+干细胞；婴儿

随着外科手术和体外循环以及术后监护技术的进步，小儿心外科手术的预后得到明显改善。但是婴幼儿心内直视手术后的重要脏器并发症的发生率仍然较高，如：神经系统功能障碍发生率高达10%～ 25%、以及肺、肾、全身炎症反应等［1-5］。深低温停循环（deep hypothermia circulatory arrest，DHCA）加选择性脑灌注（selective cerebral perfusion，SCP）由于手术视野无血、操作方便是目前修补复杂先天性心脏畸形的常用体外循环（extracorporeal circulation，ECC）方法。虽然证实在低温下对神经系统等器官有保护效果，但一定时程的血流阻断（如DHCA），仍然会引起脑缺血损伤［6-7］。

由于手术损伤造成的缺血、炎症等会引起骨髓内C-kit+细胞产生应答向外周血动员［8-9］，且大量研究表明骨髓动员的内皮祖细胞对各器官的损伤及缺血的修复过程也有密切联系［10-12］。因此，本研究旨在通过比较浅低温（mild hypothermia，MH）、DHCA和DHCA+SCP三种不同转流方法对婴儿外周血内CD34+/c-kit+干细胞表达水平的影响，比较三种转流术后的先心病婴儿是否存在不同程度的骨髓向外周血动员修复的可能性，为将来提高临床治疗效果提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 33例先天性心脏病婴幼儿，男20例，女13例。年龄1～16个月，体重3～12 kg。分为MH组10例，DHCA组10例和DHCA+SCP组13例，（见表1）。本研究符合本院人体试验伦理委员会制定的伦理学标准，所有入选病例均取得家属的知情同意。

表1 各组患儿的年龄、体重与ECC时间（±s）

表1 各组患儿的年龄、体重与ECC时间（±s）

1.2 麻醉及ECC方法 均采用静吸复合麻醉，经口气管插管。ECC预充液由勃脉力A、5%碳酸氢钠、10%葡糖糖酸钙、速尿、20%甘露醇、红细胞悬液、20%人血白蛋白、甲泼尼龙、肝素、抗生素等组成。MH组以100 ml/（kg·min）的灌注流量，浅低温（34℃）转流后复温；DHCA及DHCA+SCP组的ECC降温采用体表及快速转流降温技术，通过调节流量与水温控制降温速度，降至肛温18～20℃，鼓膜温16～18℃，DHCA组停止ECC；DHCA+SCP组将主动脉插管移至无名动脉内，灌注流量15～20 ml/（kg·min），主动脉手术修补结束后将插管退回主动脉，复温排气后恢复ECC。血气管理方式采用α-稳态及pH稳态相结合的方式，转流结束后三组均作改良超滤。

1.3 样本采集和测定 分别于ECC前（T0），ECC结束后12～24 h（T1），ECC结束后4～5 d（T2）三个时相点抽取外周动脉血行流式细胞仪（Beckman公司）计数检测。CD34-PE、CD117-APC抗体及溶血素（Beckman公司）。取试管2支分别加入500 μl外周血样本，各加1支溶血素10 ml，充分混匀，室温放置15～20 min，至悬液澄清，400 g离心3～5 min，弃上清，加入PBSA 2 ml混匀，400 g离心3～5 min，洗涤一次。弃上清，分别加入PBS 100 μl重悬细胞备用。在上述两份已裂红处理样本中加入同型对照抗体及CD34、CD117抗体，充分混匀后室温避光孵育20 min，反应结束后各加入2 ml PBSA混匀，400 g离心3～5 min，洗涤一次。弃上清，加入适量PBSA混匀后上机检测，先利用同型对照管调节流式细胞仪的电压条件，再进行测试管的检测［13］。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行统计，实验结果均以±标准差（±s）表示。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计学显著性分析，P＜0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 T0 MH组，DHCA组和DHCA+SCP组患者的外周血CD34+/c-kit+干细胞含量分别为（1.71 ±0.10）个/1 000个裂红细胞、（1.94±0.23）个/1 000个裂红细胞和（1.79±0.12）个/1 000个裂红细胞。结果表明三组患者外周血CD34+/c-kit+干细胞含量无显著差异（P＞0.05），见图1。

图1 T0外周血CD34+/c-kit+干细胞含量

2.2 T1 MH组，DHCA组和DHCA+SCP组患者的外周血CD34+/c-kit+干细胞含量分别为（1.51±0.31）个/1 000个裂红细胞、（2.20±0.36）个/1 000个裂红细胞和（1.45±0.14）个/1 000个裂红细胞。结果表明DHCA组CD34+/c-kit+干细胞含量较MH组以及DHCA+SCP组显著升高（P＜0.01），见图2。

2.3 T2 MH组，DHCA组和DHCA+SCP组患者的外周血CD34+/c-kit+干细胞含量分别为（0.55±0.25）个/1 000个裂红细胞、（3.46±1.10）个/1 000个裂红细胞和（0.63±0.28）个/1 000个裂红细胞。结果表明DHCA组CD34+/c-kit+干细胞含量较MH组以及DHCA+SCP组升高更为显著（P＜0.01）。见图3。

图2 T1外周血CD34+/c-kit+干细胞含量

图3 T2外周血CD34+/c-kit+干细胞含量

3 讨 论

有文献报道低温对CD34及C-kit干细胞表达可能产生一定影响，深低温环境下CD34干细胞会有一定程度的活性及动员［14-15］，但有关低温对CD34+/c-kit+干细胞含量影响的临床意义及其机制尚不清楚。本研究发现DHCA组患者手术后5天内的外周血CD34+/c-kit+干细胞含量持续高表达，但是DHCA+SCP组患者的外周血CD34+/c-kit +干细胞含量则明显得到抑制，且与MH组相仿。本实验研究还发现MH组与DHCA+SCP组患者的外周血CD34+/c-kit+干细胞表达含量无论在T0、T1、T2均无明显统计学变化（P＞0.05），而DHCA组患者的外周血CD34+/c-kit+干细胞表达含量在这三个时相都显著升高。从低温的角度看，不同程度的低温对骨髓动员向外周血干细胞的水平可能存在不同程度的调节作用。另一方面，选择性灌注造成的内环境改变可能对骨髓动员也存在一定理化方面的影响。

CD34选择性表达于人类及哺乳动物造血干细胞及造血祖细胞表面，且随着细胞的成熟逐渐消失，在介导细胞黏附、造血干细胞的运输、炎症反应、淋巴细胞归巢等有重要作用。CD117是由c-Kit基因编码的酪氨酸受体，表达于造血干细胞亚群、肥大细胞等［16-19］。近年来，科学家将外周血中的干细胞分成7个大类，其中CD34+/CD117+的干细胞属于早期的内皮祖细胞类（endothelial progenitor cells，EPCs）［20］。现阶段有大量的文献及研究证实EPC与心脑血管的损伤修复有着紧密的联系，缺血损伤、应激、细胞因子、药物等因素都可能造成EPC向损伤部位的迁移。EPC可通过自身分化增殖形成新生血管，也可以分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等细胞生长因子促进本身的血管内皮增值改善供血，其具体机制可能与PI3K/Akt信号通路影响其迁移、Notch/Jagged1信号通路影响其增值分化等有关［21--24］。

小儿ECC转流对EPC的影响尚无相关报道，仅有报道称在成人ECC心脏手术后阿托伐他丁类药物可能会引起EPC的升高，修复受损的血管内皮［25］，该作者通过随机双盲实验对50例接受过ECC治疗的患者研究发现患者体内的各类细胞因子水平在ECC后均有所升高［白介素（IL）-6，IL-8，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），VEGF等］显示造成了一定的炎症及内皮损伤，而阿托伐他丁类药物可以促进EPC的动员，显著降低了促炎症因子的水平。由于小儿生长发育的特殊性及临床试验的限制，所以本实验尝试通过外周血内CD34+/c-kit+干细胞含量间接反应EPC的动员情况，通过实验结果可以发现DHCA会造成小儿体内此类干细胞水平的上升，且术后4-5d更为显著，而加入SCP的体外转流方式即DHCA+SCP组患者的此类干细胞的水平与MH组患者的水平一致且都相对较低。从损伤修复的角度，加入SCP可能减少血管内皮的损伤，减轻炎症，从而降低骨髓动员向外周血的CD34+/CD117+干细胞水平。

DHCA对机体造成的影响是十分复杂的，尤其在婴幼儿生长发育变化随年龄有显著变化的阶段，所以，需要进一步的动物实验及临床研究探讨其对骨髓动员向外周血的CD34+/c-kit+干细胞的含量变化的原因及机制，为将来临床治疗提供科学依据。

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The effects of different temperature and perfusion of cardiopulmonary bypass for the expression of the CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood in infants

Jiang Gan，Xu Zhi-wei
Department of Thoracic cardiac surgery，Shanghai Children＇s Heart center，Shanghai Jiaotong University/School of Medicine，Shanghai 200127，China

Xu Zhi-wei，Email：zwxumd＠gmail.com

ObjectiveTo investigate the effect of mild hypothermia，deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）and selective cerebral perfusion（SCP）on the expression of CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood in infants.MethodsThirty three infants with congenital cardiac diseases were divided into 3 groups：mild hypothermia group（10 cases），DHCA group（10 cases）and DHCA+SCP group（13 cases）.The expression of CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood were measured before institution of cardiopulmonary bypass（CPB）（T0），12-24 h（T1）and 4-5 d（T2）after cessation of CPB respectively.ResultsThe level of CD34 +/c-kit+stem cells in peripheral blood was significantly high in DHCA group compared with that in the other two groups at T1 and T2（P＜0.01）.ConclusionOur data show that DHCA cause the increase of CD34+/c-kit+stem cells expression in peripheral blood after surgery.

Mild hypothermia；Deep hypothermia circulatory arrest；Selective cerebral perfusion；CD34+/c-kit+stem cells in peripheral blood；Infant

R654.1

A

1672-1403（2013）02-0079-04

2012-12-27）

2013-03-19）

200127上海，上海交通大学附属儿童医学中心心胸外科

徐志伟，Email：zwxumd＠gmail.com