葎草花粉变应原皮试液诊断葎草花粉变态反应的临床评价

关　凯，程　璇，尹　佳，王良录，李　宏，孙劲旅，文利平，顾建青，青曼丽，岳凤敏

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院变态反应科，北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol,2013,7(2)：167-173

葎草(Humulusscandens)属蔷薇目桑科葎草属，为一年或多年生茎蔓草本植物，生长条件要求低，好生于沟边和路旁荒地，花期为7～9月[1]。除新疆和青海外，在全国各省区均有分布，是常见杂草之一。葎草在国外也有分布，如日本、韩国、越南。

葎草花粉症在中国北方地区非常常见。夏秋季节，中国北方大部分城市葎草花粉在空气中含量仅次于蒿属花粉，个别地区甚至高于蒿属花粉。尹佳等[2]曾报告，葎草花粉症占北京地区夏秋季花粉症患者的58%。赵京等[3]针对13～14岁儿童进行的北京地区呼吸道变态反应性疾病流行病学调查结果显示，蒿属花粉敏感者为5.7%，葎草花粉敏感者为4.2%；约50%夏秋季花粉症患者有可能在首次发病的9年内发展为季节性过敏性哮喘[4]。

进行葎草花粉变应原特异性免疫治疗(allergen specific immunotherapy, SIT)需要葎草花粉体内诊断制剂和治疗制剂。北京协和医院研制的葎草花粉变应原注射原液(Humulusscandenspollen extract, HuPE)已在临床安全应用逾50年，本研究通过使用HuPE 1∶1 000稀释液做皮内试验分别与变态反应专科医生临床综合特异性诊断和血清特异性IgE(specific IgE, sIgE)诊断进行对比，回顾性评价皮内试验结果与临床综合特异性诊断及与血清sIgE诊断结果的一致性、灵敏度和特异度，并评价其安全性。

对象和方法

对象

入选标准：(1)受试者年龄为4～75岁(含4岁和75岁)，男女不限；(2)2009年2月至7月在北京协和医院变态反应科就诊者；(3)于入选当天已在北京协和医院变态反应科完成20种常规吸入变应原皮内试验者；(4)于入选当天已在北京协和医院变态反应科用Uni-CAP系统完成至少一种吸入变应原血清sIgE检测者；(5)已签署知情同意书。

排除标准：(1)仅有吸入变应原皮内试验结果；(2)仅有变应原血清sIgE试验结果；(3)使用非Uni-CAP系统检测血清sIgE；(4)在进行皮肤试验前3 d内曾口服短效抗组织胺药物或3周内口服长效抗组织胺药物；(5)有严重过敏反应病史者；(6)有皮肤划痕征者；(7)做皮内试验时正在或2周内曾患皮肤湿疹、皮肤感染、皮炎或外伤者；(8)试验前1 d口服超过相当于泼尼松10 mgd剂量的糖皮质激素者；(9)试验前1 d内在将进行皮肤试验的上臂部使用糖皮质激素油膏者；(10)正在服用全身糖皮质激素者；(11)有严重影响全身状态的疾病者；(12)处在变态反应性疾病急性发作期者，如过敏性哮喘；(13)有肾上腺素禁忌症者；(14)妊娠期及哺乳期妇女；(15)研究者认为不适合参加试验的其他情况。

剔除标准：(1)点刺试验中阳性对照为阴性或阴性对照为阳性结果者；(2)无任何记录者。

观察方法

2009年2月10日至7月10日在北京协和医院变态反应科就诊并已完成20种吸入变应原(包括葎草花粉)皮内试验和至少一种吸入变应原(包括葎草花粉)血清sIgE检测的患者至少1000例。对其皮内试验和血清sIgE结果进行登记，并依据患者的病史和检查结果综合分析，同时由登记的变态反应专科医生对患者做出临床综合特异性诊断(以患者病史、症状、体征结合血清sIgE结果综合判断)。登记入组当天详细询问患者在完成皮内试验之后是否出现不良反应。

以变态反应专科医生临床综合特异性诊断为金标准，分析HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验的特异度、敏感度、阳性预期值和阴性预期值。以血清sIgE诊断作为相对金标准，分析HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验的特异度、敏感度、阳性预期值和阴性预期值。

分析HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验不良反应发生情况，对HuPE的临床应用做出安全性评价。

皮内试验及阳性标准评定

HuPE和变应原溶媒按1∶1 000新鲜配制成皮试液，2～8℃避光保存。HuPE由新华联协和药业有限责任公司提供，浓度为1∶20 wv[5]。阴性对照液使用变应原溶媒，由山西太原制药厂生产。阳性对照液使用0.1 mgml和0.01 mgml磷酸组织胺溶液。

皮内试验法和阳性标准评定方法详见参考文献[6]，评定标准分为-、+、++、+++、++++，共5级。

血清sIgE检测及阳性标准评定

由北京协和医院变态反应科实验室采用Pharmacia Uni-CAP系统的放射变应原吸附试验荧光酶联免疫法检测完成。

血清sIgE阳性标准评定：0级(<0.35 kUAL)，1级(≥0.35且<0.7 kUAL)，2级(≥0.7且<3.5 kUAL)，3级(≥3.5且<17.5 kUAL)，4级(≥17.5且<50 kUAL)，5级(≥50且<100 kUAL)，6级(≥100 kUAL)，共7级。

不良反应分类

局部反应：风团和红晕反应，局部反应和大局部反应详见参考文献[7]。全身反应：指注射处以外的组织和(或)器官出现症状，根据全身反应的严重程度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类[8-9]。

统计学处理

使用SPSS 17.0统计软件分析，对有效性和安全性结果分别进行描述，对连续变量描述观察值的数量、均值、标准差、中位数、最小值和最大值，对分类变量描述其每一种类的例数和百分比。通过四格表形式给出诊断试验结果，并计算出灵敏度，特异度，阳性预测值，阴性预测值等评价结果。未作特殊说明，统计检验均采用双侧检验，检验水准为0.05。

结　　果

一般情况

共入组1 043例受试者，其中16例因组胺对照阴性和变应原溶媒对照阳性从有效性评价中剔除。最终有效性评价1027例，安全性评价1043例。

1 043例患者男女之比为469∶574，年龄均数为33.40年，标准差为14.46年，中位数为34.57年，最大值为75.17年，最小值为4.40年，有1例受试者年龄资料缺失。所有受试者中，87.34%(9111 043)患过敏性鼻炎，57.05%(5951 043)患过敏性哮喘，30.58%(3191 043)患过敏性结膜炎，患荨麻疹、过敏性咳嗽和湿疹的受试者分别为4.99%(521 043)、3.84%(401 043)和1.73%(181 043)，0.58%(61 043)患其他变态反应性疾病。

以变态反应专科医生临床综合特异性诊断作为金标准的有效性评价

以葎草花粉皮内试验结果≥“+”为诊断界值，变态反应专科医生临床综合特异性诊断和葎草花粉皮内试验均为阳性者229例，两者均为阴性者542例(表1)。此时葎草花粉皮内试验灵敏度的点估值为0.880 8(可信区间为84.14%，92.02%)，特异度的点估值为0.8603(可信区间为83.32%，88.74%)，阳性预测值为0.7224，阴性预测值为0.9459，准确度的点估值为0.8663。

以葎草花粉皮内试验结果≥“++”为诊断界值，变态反应专科医生临床综合特异性诊断和葎草花粉皮内试验均为阳性者161例，两者均为阴性者623例(表1)。此时葎草花粉皮内试验灵敏度的点估值为0.619 2(可信区间为56.02%，67.83%)，特异度的点估值为0.988 9(可信区间为98.07%，99.71%)，阳性预测值为0.958 3，阴性预测值为0.862 9，准确度的点估值为0.880 9。

受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析：曲线下面积( area under roc curve，AUC)为0.92(图1)，95%可信区间为(0.896，0.943)。

以葎草变应原血清sIgE诊断作为相对金标准的有效性评价

以葎草花粉皮内试验结果≥“+”为诊断界值时，葎草花粉皮内试验和血清sIgE检测结果均为阳性者者219例，均为阴性者者58例(表2)。葎草花粉皮内试验灵敏度的点估值为0.876 0(可信区间为83.51%，91.69%)，特异度的点估值为0.568 6(可信区间为47.25%，66.47%)，阳性预测值为0.832 7，阴性预测值为0.651 7，准确度的点估值为0.786 9

表1　皮内试验结果与临床综合诊断比较

IDT：皮内试验

图1葎草花粉皮内试验结果ROC曲线

Fig1ROC curve of intradermal skin test withHumuluspollen extract

ROC：受试者工作特征

。

以葎草花粉皮内试验结果≥“++”为诊断界值时，葎草花粉皮内试验和血清sIgE检测结果均为阳性者者149例，均为阴性者者94例(表2)。葎草花粉皮内试验灵敏度的点估值为0.5960(可信区间为53.52%，65.68%)，特异度的点估值为0.9216(可信区间为86.94%，97.37%)，阳性预测值为0.949 0，阴性预测值为0.482 1，准确度的点估值为0.690 3。

葎草花粉血清sIgE与皮内试验结果的量效关系

葎草花粉血清sIgE阳性患者中，血清sIgE水平与稀释液阳性反应程度的等级相关系数为0.6914 3(表3)。在α=0.05的水准下，认为血清sIgE水平与皮试液的阳性反应程度存在正相关(P<0.0001)。葎草花粉血清sIgE 0级患者中，葎草花粉皮试“+”36例，“++”6例，“+++”和“++++”各1例。

表2　皮内试验结果与血清特异性IgE结果比较

IDT：皮内试验

表3　不同级别血清sIgE阳性患者皮内试验反应程度

IDT：皮内试验；±：程度介于“-”和“+”间，表示风团和红晕仅有1项为“+”标准

安全性分析

在全部1043例受试者中，有28例在进行皮内试验后出现与葎草花粉变应原有关的不良反应(葎草花粉变应原皮内试验结果≥“+++”)。27例为局部不良反应，占总人数的2.59%。1.24%(131 043)为注射部位持续红肿超过24 h，1.15%(131 043)为注射部位硬结，0.19%(21 043)为远离皮试部位的瘙痒。1例为Ⅰ类全身不良反应，表现为一过性鼻痒、喷嚏及流涕，该患者葎草花粉皮内试验“+++”，同时蒿属花粉、圆柏花粉皮内试验均为“++++”。

讨　　论

葎草花粉症在中国北方地区非常常见，尹佳等[4]观察1120例葎草花粉或蒿属花粉敏感的夏秋季花粉症患者，研究显示15～34岁是夏秋季花粉诱发鼻炎的高发年龄段，25～44岁是诱发哮喘的高发年龄段，有48%的过敏性鼻炎患者在9年内发展为过敏性哮喘。夏秋季花粉症患者有可能发展为季节性过敏性哮喘是一个不能忽视的临床问题。为防止哮喘的发生与加重，应尽早对葎草花粉诱发的中重度和(或)持续性鼻炎和哮喘患者开始SIT[4,10-12]，而明确诊断是给予葎草花粉症患者SIT的前提。

变应原特异性诊断包括体内和体外试验。体内试验包括皮肤试验和变应原激发试验，体外试验包括血清sIgE检测。严格上讲，只有规范的激发试验才是变应原诊断的金标准。然而，由于激发试验存在潜在风险，对医护人员及实验室设备要求较高，无法在临床上广泛开展。皮肤试验迄今应用已逾百年，是局限化、缩小版的激发试验，接近真实的变态反应。瑞典PHARMACIA公司Uni-CAP变应原检测方法是国际上公认最权威的体外变应原诊断方法之一。北京协和医院于1992年将该检测方法引入国内以来，已得到广泛应用。相关文献报道皮肤试验与体外血清sIgE检测有较好的相关性[13-15]。

任何一种诊断试验都需要结合临床信息才能得到临床诊断，对于变态反应性疾病的病因诊断更是如此。因此，变应原特异性诊断的金标准应该涵盖临床病史、症状和体征、变应原体内、外试验等方面，只有综合以上内容才能得出准确的临床诊断[16]。因此，本研究将临床病史、症状和体征及体外试验(血清sIgE检测)联合作为葎草花粉变态反应特异性诊断的金标准，以Uni-Cap系统血清sIgE检测结果为相对金标准，评价HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验诊断葎草花粉变态反应的临床应用价值。

皮内试验虽然灵敏度高，但可能出现假阳性[17]。Norman等[18]使用皮肤滴定试验中点法建立皮内试验剂量反应曲线，发现诱发7 mm风团直径的变应原浓度与临床症状、血清sIgE水平、组织胺释放试验和激发试验的相关性最好。本研究以变态反应专科医生临床综合特异性诊断结果作为金标准，以皮内试验结果≥“+”和≥“++”作为诊断界值时，皮内试验的灵敏度分别为88.1%和61.9%；特异度分别为86.0%和98.9%，阳性预测值分别为72.2%和95.8%，阴性预测值分别为94.6%和86.3%，准确度分别为86.6%和88.1%。由此可见，无论采用“+”还是“++”作为皮内试验阳性结果判定标准，HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验诊断葎草花粉变态反应准确度均接近90%。其中，以≥“+”为阳性判断标准时敏感度较高，以≥“++”为阳性判断标准时特异度较高。AUC用于综合评价诊断试验的灵敏度和特异度，通过检验总体ROC曲线下面积是否等于0.5来评价该诊断试验是否有价值。本试验的AUC为0.92，95%可信区间为(0.896，0.943)，说明HuPE 1∶1 000稀释液皮内试验诊断葎草花粉变态反应的临床应用诊断价值较高。

另外，以Uni-Cap系统血清sIgE检测结果作为相对金标准，将葎草花粉皮内试验检查结果与葎草变应原血清sIgE诊断结果进行对比，分别以皮内试验结果≥“+”和≥“++”为诊断界值时，灵敏度为87.6%和59.6%，特异度为56.9%和92.2%。相对专科医生临床综合诊断标准，以血清sIgE检测作相对金标准评价葎草花粉皮内试验的特异度较低，44例血清sIgE为0级的患者葎草花粉皮试阳性，其中“+”36例，“+++”和“++++”2例。同样，在皮内试验阴性的患者中，也有25例血清sIgE阳性。

在葎草花粉血清sIgE阳性患者中，血清sIgE水平与葎草花粉变应原皮试液的阳性反应程度的等级相关系数为0.69143，在α=0.05水准下可以认为血清sIgE水平与皮试液的阳性反应程度存在正相关，显示皮内试验结果和血清sIgE检测值具有很好的相关性。

皮肤试验受皮试液、皮试设备、受试者皮肤反应、操作者手法以及合并用药等多方面影响，有可能出现假阳性和假阴性反应[19]。本研究中，皮内试验与体外试验结果部分不一致，除了上述原因外，还可能与国产过敏原制剂与国外进口制剂原料来源差异相关。北京协和医院变态反应科曾用国产葎草花粉变应原建立酶联免疫吸附试验，并与Uni-Cap系统检测方法进行比较，结果显示使用国产葎草花粉变应原所建方法的灵敏度高于Uni-Cap系统，使用Uni-Cap和酶联免疫吸附试验检测血清sIgE的106例患者中，7例皮内试验和酶联免疫吸附试验检测均阳性而Uni-Cap检测阴性；皮内试验和Uni-Cap检测均阳性者，无一例酶联免疫吸附试验结果阴性[20-21]。Uni-Cap系统所用抗原为日本葎草(Japanese hop)花粉变应原，推测中国产葎草(Humulusscandens)花粉变应原和前者在变应原组份构成上可能不同，Uni-Cap检测假阴性可能是由于结合在固相载体上的日本葎草花粉变应原未包含全部中国产葎草的致敏蛋白。

1 043例受试者中，共有28例出现与葎草花粉变应原有关的不良反应。27例局部不良反应按出现频率高低依次为注射部位持续红肿超过24 h，注射部位硬结，远离皮试部位的瘙痒。1例为Ⅰ类全身不良反应，表现为一过性鼻痒、喷嚏、流涕，该患者葎草花粉皮内试验“+++”，蒿属花粉、圆柏花粉皮内试验均为“++++”，同时进行包括上述两种花粉在内的20种变应原皮内试验可能是发生全身不良反应的原因。

综上所述，HuPE 1∶1 000稀释液具有操作简单、安全、高灵敏度、高特异性的优点，可用于葎草花粉所致变态反应性疾病的辅助诊断，还可为特异性脱敏治疗提供可靠的客观依据。

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